TRAITEMENT DES ÉCHANTILLONS DE LIQUIDE AMNIOTIQUE

  1. Centrifugez 2 à 5 ml d'échantillon de liquide amniotique (LA) total pendant 5 minutes à 1 000 tr/mn. L'échantillon ne doit pas être trouble ou brun. 
  2. Remettez le culot en suspension dans 2 à 5 ml de solution 1X Trypsine/EDTA (trypsine à 0,05 %, EDTA 4Na 0,53 mM dans une solution saline équilibrée de Hanks sans CaCl2, MgCl2 6H2O et MgSO4 7H2O) et incubez dans un bain-marie à 37 °C pendant au moins 15 minutes.
  3. Centrifugez la suspension pendant 5 minutes à 1 000 tr/min.
  4. Remettez le culot en suspension dans 2 à 5 ml de KCl à 0,56 %et incubez pendant 20 minutes dans un bain-marie à 37 °C.
  5. Ajoutez 0,8 à 2 ml de fixateur (3:1, méthanol:acide acétique glacial) dans les cellules/la solution hypotonique et placez la solution dans un mélangeur vortex.
  6. Centrifugez la suspension pendant 5 minutes à 1 000 tr/min et remettez le culot en suspension dans 1 ml de fixateur frais. Stockez les échantillons fixés à 4 °C pendant au moins 30 minutes ou jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour le test FISH. Pour le stockage à long terme, stockez les échantillons fixés à -20 °C dans un fixateur.
  7. Avant de placer les cellules sur des lames, ajustez le volume de suspension des cellules en fonction de la taille du culot de cellules. Si nécessaire, en particulier après un stockage prolongé (>1 mois), lavez les culots avec le fixateur avant la préparation des lames.
  8. Pour préparer les lames pour le test FISH, versez des gouttes de la suspension cellulaire directement sur 1 ou 2 lames de verre froides, en réalisant 2 zones d'hybridation (15 à 25 µl de suspension cellulaire par zone).

 Utilisez ensuite le kit de prétraitement FISH.

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