Preguntas más frecuentes

Aplicaciones

 

¿Puedo realizar la prueba de FISH más de una vez en la misma zona de hibridación?

Sí. Consulte la sección de protocolos correspondiente a la prueba de FISH secuencial.

 

¿Cuál es el tamaño más pequeño de ADN (secuencia de ADN contigua) que se puede ver con las sondas marcadas directamente de Vysis (CEP o LSI)?

El tamaño depende de varios factores; en general, el límite mínimo es de unas 30 kilobases.

 

¿Cómo se pueden mezclar dos sondas?

Añada 7 µl de tampón de hibridación, 1 µl de agua purificada y 1 µl de cada una de las sondas hasta un volumen total de 10 µl.

 
 
 
 
Filtros

 

¿Qué filtros se recomiendan para PathVysion, UroVysion y AneuVysion?

  • PathVysion: (3 filtros) verde/naranja v.2, DAPI/9-naranja, y filtro de paso único verde. 
  • UroVysion: (4 filtros) DAPI, rojo/verde, oro y aguamarina. 
  • AneuVysion: (4 filtros) DAPI/naranja/verde, paso único verde, paso único naranja y paso único aguamarina. 

Para obtener información sobre filtros de otros productos, póngase en contacto con el servicio técnico de Vysis en el número 1-800-553-7042 x2.

 

¿Qué tipo de fuente de luz es la más adecuada para ver la fluorescencia?

Se recomienda una lámpara de mercurio de 100 vatios y debe cambiarse cada 200 horas.

 

¿Por qué las señales fluorescentes son tenues?

Además de usar el filtro apropiado, la fuente de excitación del microscopio y la antigüedad de la lámpara afectarán a la intensidad de la señal del fluoróforo. Se recomienda una lámpara de mercurio de 100 vatios con menos de 200 horas de uso. Algunas señales de sondas son más brillantes o tienen formas diferentes a las de otras señales de sonda. Por ejemplo, una señal LSI® es más compacta que una señal CEP® y el usuario puede interpretar esto como una señal menos brillante. Lo que ocurre en realidad es que la señal de LSI es más pequeña. Las diferentes pinturas de cromosomas WCP® tienen diferentes intensidades de tinción y un usuario puede describir una determinada pintura de cromosomas WCP® como no tan brillante como la que usaba antes.

 

¿Se puede usar un filtro rojo de Texas para ver las sondas SpectrumOrange de Vysis?

No, las sondas SpectrumOrange requieren un filtro SpectrumOrange de Vysis. Las longitudes de onda del rojo y el naranja están lo suficientemente cerca en el espectro como para que se vean las señales, pero la intensidad de la señal no será reproducible.

 

¿Se puede usar un filtro dorado para ver las sondas SpectrumOrange de Vysis?

No, las sondas SpectrumOrange requieren un filtro SpectrumOrange de Vysis. Las longitudes de onda del dorado y el naranja están lo suficientemente cerca en el espectro como para que se vean las señales, pero la intensidad de la señal no será reproducible.

 
 
 
 
General

 

¿Cuál es la diferencia entre una autorización y una aprobación de la FDA?

La aprobación de la FDA se refiere a los productos que están aprobados para su comercialización sujeta al proceso PMA (aprobación previa a la comercialización) para dispositivos nuevos. La autorización de la FDA se refiere a los dispositivos que están autorizados para su comercialización sujeta a una revisión 510 (K). Por lo general, el proceso PMA es más estricto y se dirige a productos verdaderamente novedosos. Los dispositivos que son conceptualmente similares a los que ya se encuentran en el mercado, o que representan mejoras con respecto a los productos existentes, pueden escoger la autorización de la FDA sujeta a una revisión 510(K).

 

¿Puede Vysis ofrecer consejos sobre cómo notificar los resultados de un paciente?

No. Vysis no es un laboratorio clínico y no puede ofrecer opiniones sobre cómo notificar los resultados de un paciente. Vysis tampoco puede ofrecer asesoramiento sobre nomenclatura.

 

¿Qué diferencia hay entre ASR e IVD?

ASR son las siglas en inglés de "reactivos específicos de analitos" Los ASR son productos destinados a usarse en pruebas internas de fermentación, que cuentan con garantías de buena práctica de fabricación del fabricante. Los ASR deben etiquetarse según lo dispuesto en la norma 21 CFR § 809.10(e). Los materiales publicitarios y promocionales están regulados por la norma 21 CFR § 809.30(D). El laboratorio que desarrolle una prueba interna utilizando los ASR deberá informar al ordenante del resultado de la prueba adjuntando al informe de la prueba la siguiente declaración con arreglo a la norma 21 CFR § 809.30(e): "Esta prueba ha sido desarrollada y sus características de desempeño han sido determinadas por (nombre del laboratorio). No ha obtenido la autorización ni la aprobación de la FDA de Estados Unidos de América". Los ASR no poseen ninguna reivindicación de uso previsto; el laboratorio es responsable de establecer el uso previsto y los límites. Ejemplos de productos ASR de Vysis: LSI® bcr/abl, LSI DiGeorge, TotelVysion. IVD son las siglas en inglés de diagnóstico in vitro: producto de diagnóstico autorizado o aprobado por la FDA para uno o más usos específicos con características establecidas de rendimiento analítico y clínico. Ejemplos de productos IVD de Vysis: PathVysion, UroVysion, AneuVysion, CEP® 8 SO, CEP 12 SO, CEP X/Y.

 

¿Por qué los números de lote que figuran en los viales son distintos de los que figuran en el kit?

El número de lote que aparece en el certificado de análisis que se suministra con cada sonda es el número de lote del kit. La mayoría de los kits están compuestos por un vial de sonda y un vial de tampón de hibridación. Otros kits contienen sonda premezclada con tampón de hibridación. Cada uno de los componentes tiene una referencia única y un número de lote distinto de los del kit. Cuando se pide el producto en nuestro catálogo, el número que se utiliza es el número de catálogo, no las referencias individuales que aparecen en los viales incluidos en el kit.

 
 
 
 
Sondas

 

¿Hasta qué punto son estables las sondas? ¿Se pueden congelar y descongelar? ¿Se pueden conservar diluidas? 

Si se conservan correctamente, las sondas son estables. Se pueden congelar y descongelar varias veces. El riesgo de degradación de las sondas es menor si se almacenan sin diluir.

 

¿Es necesario amplificar la señal?

No, no es necesario amplificar la señal. Las sondas marcadas directamente de Vysis ofrecen una señal nítida sin ningún paso de detección adicional.

 

¿Puedo disminuir la cantidad de sonda por ensayo?

No, en ese caso la intensidad de la señal será demasiado débil.

 

¿Qué diferencia hay entre las sondas marcadas directamente y las sondas marcadas indirectamente?

En las sondas marcadas directamente, el fluoróforo se une covalentemente a la sonda de ADN. En las sondas marcadas indirectamente, un hapteno, como la biotina o la digoxigenina, se incorpora a la sonda. Una serie de pasos poshibridación (tipo sándwich) permite que un fluoróforo se una al hapteno.

 

¿Cuándo se usan las sondas WCP y cuando las CEP?

Las sondas CEP se emplean tanto en células en interfase como en extensiones de metafases y pueden utilizarse para determinar la ploidía (por ejemplo, trisomía 18). Las sondas de "pintado" de cromosomas completos (WCP) se usan solamente en extensiones de metafases. La comunidad científica desaconseja su uso en células en interfase debido a las dificultades que plantea para la interpretación de los resultados.

 

¿Las sondas WCP tienen reactividad cruzada con otros cromosomas humanos o con cromosomas de roedores?

Con las sondas WCP pueden producirse algunas reacciones cruzadas con otros cromosomas humanos. La mezcla de sondas contiene ADN Cot-1®* humano para reducir la unión a secuencias repetidas en el ADN diana y no diana. Se puede añadir más ADN Cot-1 humano. Algunas de las sondas WCP se preparan a partir de bibliotecas de ADN de cromosomas humanos clasificados por flujo obtenidos a partir de híbridos de células somáticas humanas y de hámster. Utilice el ADN Cot1 de hámster de GIBCO/BRL o el ADN Cot1 de ratón de GIBCO/BRL como reactivo bloqueante si analiza híbridos de células somáticas para determinar su contenido cromosómico humano.

 

Si se mezclan sondas LSI y CEP, ¿qué tampón de hibridación se utiliza?

Utilice el tampón de hibridación LSI. El tampón CEP es más riguroso, el LSI, el menos. El LSI requiere el tampón menos riguroso; de lo contrario, podría no hibridar con su diana. Vysis no ha probado todas las configuraciones de combinación de LSI y CEP. Es posible que para algunas mezclas de sondas, la sonda CEP pueda experimentar hibridación cruzada con otros cromosomas debido a las condiciones menos rigurosas.

 

¿Cómo se pueden mezclar dos sondas?

Añada 7 µl de tampón de hibridación, 1 µl de agua purificada y 1 µl de cada una de las sondas hasta un volumen total de 10 µl.

 

¿Por qué las señales fluorescentes son tenues?

Además de usar el filtro apropiado, la fuente de excitación del microscopio y la antigüedad de la lámpara afectarán a la intensidad de la señal del fluoróforo. Se recomienda una lámpara de mercurio de 100 vatios con menos de 200 horas de uso. Algunas señales de sondas son más brillantes o tienen formas diferentes a las de otras señales de sonda. Por ejemplo, una señal LSI es más compacta que una señal CEP y un usuario puede interpretar esto como una señal menos brillante. Lo que ocurre en realidad es que la señal de LSI es más pequeña. Las diferentes pinturas de cromosomas WCP tienen diferentes intensidades de tinción y un usuario puede describir una determinada pintura de cromosomas WCP como no tan brillante como la que usaba antes. En comparación con algunas señales amplificadas de sondas marcadas indirectamente, algunos usuarios podrían considerar que la señal de las sondas marcadas directamente es débil. Las señales de las sondas Vysis pueden parecer más pequeñas, pero la señal es igual de brillante. Además, debido a la ausencia de fluorescencia de fondo, la señal es más fácil de ver y distinguir que una señal real.

 
 
 
 
Preparación de muestras

 

¿Qué aspecto deben tener mis portaobjetos (con preparaciones de metafases) antes de la prueba de FISH?

Evalúe sus preparaciones de portaobjetos con un microscopio de contraste de fase.

  • Preparación correcta: Los cromosomas y núcleos deben ser de color gris opaco, no refractarios y con un citoplasma mínimo.
  • Preparación deficiente: Las células estarán en "fase brillante", mostrándose blancas con un halo alrededor de los núcleos. Causa posible: La muestra de los portaobjetos puede haberse secado demasiado rápido durante la preparación. Solución:
    • Aumentar la humedad alrededor del portaobjetos al depositar la muestra, colocándola en una gradilla sobre un baño de agua a 65 °C durante 20 minutos.
    • No meta en la estufa los portaobjetos ya que podría afectar negativamente a los resultados de la hibridación.
    • Deje secar los portaobjetos a temperatura ambiente durante la noche. Los mejores resultados se obtienen cuando se dejan reposar los portaobjetos durante la noche a temperatura ambiente.
  • Los portaobjetos preparados y utilizados el mismo día no ofrecen las condiciones óptimas, pero se pueden seguir los pasos que se indican a continuación para preparar los portaobjetos en un solo día: seque el portaobjetos primero en un calentador de portaobjetos a 45 °C durante 30 minutos, luego deshidrate el portaobjetos durante un minuto en soluciones de etanol al 70 %, 85 % y 100 % respectivamente antes de desnaturalizar el ADN diana (paso 1 de FISH).

 

Después de la prueba de FISH, observo una señal tenue y una especie de neblina que cubre el portaobjetos. ¿Cómo puedo corregir esto?

Por lo general, la causa es una densidad demasiado alta de células que se depositan sobre el portaobjetos. La neblina se debe al citoplasma celular. Pruebe a lavar el pellet de células con fijador fresco, diluya la muestra y deposítela sobre un portaobjetos nuevo. Algunos tipos de muestras (improntas, frotis de médula ósea o sangre, muestras incluidas en parafina) pueden ser más propensas a generar un problema de neblina. Estos tipos de muestras pueden requerir tratamientos adicionales:

  • Frotis: 30 segundos de lavado en ácido acético al 70 %, secado al aire, 30 segundos de lavado en metanol al 100 %.
  • Incluidas en parafina: aumento del tiempo de digestión de las proteínas.

 

¿Por qué la tinción de contraste es demasiado débil?

Es posible que los portaobjetos no se hayan secado correctamente antes de aplicar la tinción de contraste. Asegúrese de dejar reposar los portaobjetos durante 24 horas después de depositar las células. Pruebe a deshidratar las muestras con una serie de lavados con etanol y luego vuelva a aplicar la tinción de contraste. Asegúrese también de disponer del filtro adecuado para ver la tinción de contraste. Vysis ofrece dos concentraciones de tinción de contraste DAPI. DAPI II (125 ng/ml) está pensado para usarse con sondas CEP® y LSI®; se trata de una solución diluida ocho veces de DAPI I (1000 ng/ml) que se emplea con las pinturas de cromosomas WCP®. El uso de DAPI II con sondas WCP puede producir una tinción de contraste demasiado débil.

 

¿Por qué la morfología celular de mi muestra está distorsionada?

Cada tipo de tejido o muestra puede requerir un tiempo de desnaturalización diferente. Si el tiempo de desnaturalización es demasiado largo para el tipo de muestra, las células se mostrarán distorsionadas. Intente un tiempo de desnaturalización de cuatro minutos para comenzar y después ajústelo como corresponda.

 

¿Durante cuánto tiempo puedo conservar mis portaobjetos preparados y seguir teniendo la posibilidad de hacer una hibridación eficiente?

Si los portaobjetos se mantienen a -20 °C bajo nitrógeno, deben poder utilizarse durante al menos seis meses.

 

Después de la hibridación, ¿durante cuánto tiempo puedo conservar mis portaobjetos y seguir viendo la fluorescencia?

Si los portaobjetos se mantienen a -20 °C y no se exponen con demasiada frecuencia a la luz ultravioleta de alta intensidad de la lámpara de mercurio, durarán varios meses. Las señales se desvanecerán con el tiempo y con la exposición a la luz.

 

¿Puedo realizar una prueba de FISH después de aplicar el bandeo G a las extensiones de metafases?

Sí, la siguiente referencia bibliográfica describe un procedimiento:

 

Jalal SM, Law ME, Christensen ER, Spurbeck JL, Dewald GW. Method for sequential staining of GTL-banded metaphases with fluorescent labeled chromosome specific paint probes. Am J Med Genet 46:98-103, 1993.

 
 
 
 
Reactivos

 

¿Por qué los procedimientos de Vysis no requieren que se añada un agente "antifade" (antiextinción) al ensayo de FISH?

Las tinciones de contraste de Vysis, DAPI I, DAPI II y yoduro de propidio, contienen todas ellas agentes "antifade" en la solución.

 

La solución de lavado que contiene 0,1 % de NP-40 se enturbia al calentarse. ¿Qué es lo que ocurre?

No hay de qué preocuparse. La apariencia turbia es normal y no interferirá en el lavado.

 

¿Qué diferencia hay entre DAPI I y DAPI II?

DAPI I contiene 1000 ng/ml, aproximadamente 8 veces la concentración de DAPI II, que es de 125 ng/ml. DAPI I está más concentrado y funciona bien con las pinturas de cromosomas WCP®, además de proporcionar una tinción de contraste visual brillante para los cromosomas en metafase. DAPI II está menos concentrado y se utiliza con las sondas CEP® y LSI®, que tienen señales más compactas que pueden quedar saturadas por un exceso de tinción de contraste DAPI del ADN nuclear.

 

¿Qué diferencia hay entre los kits de pretratamiento de parafina I, II y III?

El kit de pretratamiento de parafina I debe usarse con muestras de tejido para PathVysion® Her-2 neu. Cuentan con la aprobación de la FDA para este kit. Es un pretratamiento más lento (aproximadamente una hora más largo) que el del kit II. El kit de pretratamiento de parafina II es un protocolo de pretratamiento más corto para utilizarse en cortes de parafina que no sean para PathVysion HER-2 y tejido prostático. El kit de pretratamiento de parafina III es un protocolo más riguroso que debe usarse en tejido prostático o para la solución de problemas en muestras difíciles. Este kit contiene la enzima proteinasa K en lugar de pepsina.

 

¿Cuáles son los componentes de los tampones de hibridación?

  • Tampón de hibridación CEP: formamida al 55 %, 1XSSC, sulfato de dextrano al 10 %
  • Tampón de hibridación LSI/WCP: formamida al 50 %, 2XSSC, sulfato de dextrano al 10 %
 
 
 
 

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