ToTelVysion TM: Mezclas de sondas de ADN multicolor para FISH

ToTelVysionTM: Mezclas de sondas de ADN multicolor para FISH

Pretratamiento de muestras para codesnaturalización.

 

Es muy recomendable llevar a cabo el siguiente procedimiento de pretratamiento antes de la hibridación con las sondas ToTelVysion en preparaciones de metafases en portaobjetos. El propósito de este procedimiento es hacer que el ADN cromosómico sea accesible para la hibridación y proteger la morfología de los cromosomas frente al proceso de codesnaturalización.

  1. Incube los portaobjetos con las muestras en una cubeta tipo Coplin con solución 2X SSC a 73 °C durante 2 minutos. 
  2. Incube los portaobjetos en una cubeta tipo Coplin con solución de proteasa/pepsina durante 10 minutos a 37 °C. 
  3. Lave los portaobjetos en una cubeta tipo Coplin con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos. 
  4. Coloque los portaobjetos en una cubeta tipo Coplin con solución de formaldehído durante 5 minutos a temperatura ambiente. 
  5. Saque los portaobjetos de la solución de formaldehído y lávelos en una cubeta tipo Coplin con PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. 
  6. Deshidrate los portaobjetos durante 1 minuto en etanol al 70 % y, a continuación, 1 minuto en etanol al 85 % y 1 minuto en etanol al 100 %. 
  7. Deje los portaobjetos secar al aire.

 

La mezcla de sondas ToTelVysion Multi-color DNA FISH se compone de un total de 62 sondas de ADN para FISH.

 

 
Componente Sonda ToTelVysion Multi-color DNA
Cantidad 30 µl × 15 viales con varias mezclas de sondas
Composición Sondas TelVysion, CEP® y LSI® marcadas con fluoróforos y ADN bloqueante mezclado con tampón de hibridación con sulfato de dextrano, formamida y SSC (pH 7,0).
Conservación -20 °C y protegido de la luz 
 
 
N.º DE VIAL TOTELVYSION DESCRIPCIÓN DE LA MEZCLA DE SONDAS
Mezcla 1 TelVysion 1p SpectrumGreen, TelVysion 1q SpectrumOrange, TelVysion Xp/Yp SpectrumOrange y SpectrumGreen, CEP X SpectrumAqua
Mezcla 2 TelVysion 2p SpectrumGreen, TelVysion 2q SpectrumOrange, TelVysion Xq/Yq SpectrumOrange y SpectrumGreen, CEP X SpectrumAqua
Mezcla 3

TelVysion 3p SpectrumGreen, TelVysion 3q SpectrumOrange, TelVysion 22q SpectrumOrange y SpectrumGreen, LSI bcr (22q11) SpectrumAqua

Mezcla 4 TelVysion 4p SpectrumGreen, TelVysion 4q SpectrumOrange, TelVysion 21q SpectrumOrange y SpectrumGreen, LSI AML (21q22) SpectrumAqua
Mezcla 5 TelVysion 5p SpectrumGreen, TelVysion 5q SpectrumOrange 
Mezcla 6 TelVysion 6p SpectrumGreen, TelVysion 6q SpectrumOrange, TelVysion 13q SpectrumOrange y SpectrumGreen, LSI 13 (13q14) SpectrumAqua
Mezcla 7 TelVysion 7p SpectrumGreen, TelVysion 7q SpectrumOrange, TelVysion 14q SpectrumOrange y SpectrumGreen, LSI TCR (14q11.2) SpectrumAqua
Mezcla 8 TelVysion 8p SpectrumGreen, TelVysion 8q SpectrumOrange, TelVysion 17p SpectrumOrange y SpectrumGreen, CEP 17 SpectrumAqua
Mezcla 9 TelVysion 9p SpectrumGreen, TelVysion 9q SpectrumOrange, TelVysion 17q SpectrumOrange y SpectrumGreen, CEP 17 SpectrumAqua
Mezcla 10 TelVysion 10p SpectrumGreen, TelVysion 10q SpectrumOrange, TelVysion 15q SpectrumOrange y SpectrumGreen, LSI PML (15q22) SpectrumAqua
Mezcla 11 TelVysion 11p SpectrumGreen, TelVysion 11q SpectrumOrange, TelVysion 18p SpectrumOrange y SpectrumGreen, CEP 18 SpectrumAqua
Mezcla 12 TelVysion 12p SpectrumGreen, TelVysion 12q SpectrumOrange, TelVysion 18q SpectrumOrange y SpectrumGreen, CEP 18 SpectrumAqua
Mezcla 13 TelVysion 16p SpectrumGreen, TelVysion 16q SpectrumOrange
Mezcla 14 TelVysion 19p SpectrumGreen, TelVysion 19q SpectrumOrange, LSI 19p13 SpectrumAqua
Mezcla 15 TelVysion 20p SpectrumGreen, TelVysion 20q SpectrumOrange 

 

 

Materiales necesarios no suministrados

  • HCI 12 N (para ajustar el pH de las soluciones de lavado) 
  • NaOH 1 N (para ajustar el pH de las soluciones de lavado) 
  • Cubetas tipo Coplin
  • Termómetro calibrado 
  • Pinzas 
  • Probeta graduada (de 100 a 1000 ml)
  • Agitador magnético 
  • Etanol al 100 % 
  • Microcentrífuga 
  • Puntas para micropipetas para volúmenes de 1 a 10 µl 
  • Micropipeteador para volúmenes de 1 a 10 µl 
  • Medidor de pH 
  • Portaobjetos de vidrio prelavados para microscopio 
  • Agua purificada (destilada o desionizada) 
  • Cronómetro 
  • Agitador vórtex 
  • Baño de agua (37 °C y 73 °C)
  • Microscopio de fluorescencia 
  • Incubador a 37 °C 
  • Solución tampón de citrato de sodio (SSC) 20X, 500 g (n.º de lista 02J10-032) NP-40, 4000 µl (n.º de lista 07J05-001; cantidad 2)
  • Formamida, grado ultra puro 
  • Tinción de contraste DAPI II 
  • Calentador de portaobjetos (45 a 50 °C) 
  • Aceite de inmersión para microscopio de fluorescencia 
  • Adhesivo de caucho 
  • Cubreobjetos (12 mm redondos)
  • Punzón con punta de diamante
  • Jeringa desechable
  • Tiras indicadoras de pH
  • Unidad de filtración de 0,45 µm
  • Cámara húmeda
  • Tampón fosfato salino (PBS) 
  • Formol tamponado neutro al 10 % 
  • Cloruro de magnesio 2 M (MgCl2) 
  • Proteasa/pepsina

 

Preparación de la diana de la muestra

Para hibridar las 15 mezclas ToTelVysion, use un mínimo de 3 portaobjetos para muestras con 5 áreas diana marcadas por portaobjetos para un total de 15 áreas diana.

 

totelvysion-multi-color-dna-fish-probe-mixtures-slide.gif

Ejemplo de portaobjetos n.º 1 con dianas 1, 2, 3, 4 y 5. Repita el mismo tipo de organización de dianas para los portaobjetos 2 y 3, con 5 dianas en cada portaobjetos.

 

 
 
 
 
Preparación de la sonda

Preparación de la sonda y adición de la mezcla de sondas al portaobjetos con la muestra

  1. Cada mezcla de sondas ToTelVysion se mezcla previamente y se prepara en tampón de hibridación. Saque los viales del congelador de -20 °C (±5 °C). Descongele a temperatura ambiente. 
  2. Centrifugue cada uno de los viales de mezcla de sondas descongelados durante 1-3 segundos en una microcentrífuga. 
  3. Agite en el vórtex y vuelva a centrifugar brevemente. 
  4. Retire 3 µl de sonda del vial con un micropipeteador y colóquelos en un tubo de microcentrífuga. Prepare la sonda de cada uno de los 15 viales de la misma manera. 
  5. Coloque cada uno de los tubos de microcentrífuga con 3 µl de sonda en un baño de agua a 73 ± 1 °C durante 5 minutos para desnaturalizar la sonda. 
  6. Retire los tubos del baño de agua. 
  7. Coloque los tubos en un calentador de portaobjetos a 45-50 °C hasta que estén listos para aplicar la sonda al ADN diana.

Nota: Si los portaobjetos están listos cuando la sonda está desnaturalizada, puede aplicar la sonda inmediatamente al ADN diana. 

 

Hibridación de la sonda con la diana del portaobjetos

Nota: Prepare una cámara húmeda colocando papel humedecido con agua en un lateral de un recipiente hermético. 

  1. Retire los portaobjetos del etanol al 100 %. 
  2. Seque los portaobjetos poniendo en contacto el borde inferior de los portaobjetos con un papel secante y limpiando la parte inferior de los portaobjetos con una toallita de papel. 
  3. Coloque los portaobjetos sobre un calentador de portaobjetos a 45-50 °C durante un máximo de 2 minutos para evaporar el resto de etanol. 
  4. Aplique 3 µl de la mezcla de sondas a un área diana y ponga inmediatamente el cubreobjetos redondo de 12 mm. Repita el procedimiento para las otras 14 áreas diana.

Nota: Evite que los cubreobjetos de cada área diana entren en contacto. La acción capilar entre cubreobjetos en contacto podría provocar que la sonda de una diana pasara a otra.

 

5. Selle cada cubreobjetos con adhesivo de caucho, asegurándose de que el adhesivo se superponga al borde del cubreobjetos para crear un sello hermético entre el cubreobjetos y la superficie del portaobjetos. 

 

6. Coloque los portaobjetos en cámara húmeda precalentada e introdúzcala en un incubador a 37 °C durante 12-24 horas. 

 

Lavado del portaobjetos

Prepare las soluciones de lavado:

Nota: Lleve las soluciones a la temperatura adecuada antes de iniciar el procedimiento de lavado.

  • Vierta 70 ml de 0,4X SSC/0,3 % NP-40 en una cubeta tipo Coplin. Coloque la cubeta en un baño de agua a 73 ± 1 °C al menos durante 30 minutos antes de su uso. Utilícela 1 día y, a continuación, deséchela.
  • Vierta 70 ml de 2X SSC/0,1 % NP-40 en una cubeta tipo Coplin. Utilice la solución a temperatura ambiente. Utilícela 1 día y, a continuación, deséchela.

Nota: Para mantener la temperatura adecuada en 0,4X SSC/0,3 % NP-40, lave los 4 portaobjetos simultáneamente. Si tiene menos de 4 portaobjetos, añada portaobjetos vacíos que estén a temperatura ambiente hasta hacer un total de 4.

 

 7.  Retire los cubreobjetos de un portaobjetos y sumerja inmediatamente los portaobjetos en 0,4X SSC/0,3 % NP-40 a 73 ± 1 °C. Agite los portaobjetos durante 1-3 segundos. Repita el proceso con los demás portaobjetos.  

 

8.   Retire los portaobjetos después de 2 minutos.

 

9.  Sumerja los portaobjetos en 2X SSC/0,1 % NP-40 a temperatura ambiente. Agite los portaobjetos durante 1-3 segundos. Retire los portaobjetos una vez transcurridos entre 30 segundos y 2 minutos. 

 

Visualización de la hibridación

  1. Deje los portaobjetos secar en oscuridad.
  2. Aplique 3 µl de tinción de contraste DAPI II a cada área diana de los portaobjetos y ponga un cubreobjetos redondo de 12 mm. Alternativamente, aplique 10 µl de tinción de contraste DAPI II a cada mitad de los portaobjetos y ponga un cubreobjetos de 22 × 50 mm sobre la tinción de contraste. Presione suavemente en la parte superior de los cubreobjetos para eliminar el exceso de DAPI. Seque con una toallita de papel. 

Ajuste de los parámetros ThermoBrite

Coloque inmediatamente cada uno de los portaobjetos (con la sonda y el cubreobjetos aplicados) sobre la superficie de la placa del sistema ThermoBrite. Humedezca las tiras de humedad con agua y colóquelas en la tapa.

  1. Selle cada cubreobjetos con adhesivo de caucho, asegurándose de que el adhesivo se superponga al borde del cubreobjetos para crear un sello hermético entre el cubreobjetos y la superficie del portaobjetos.
  2. Para linfocitos y amniocitos cultivados, ajuste la temperatura de desnaturalización en 70 °C y el tiempo de desnaturalización en 3 minutos. (Nota: Estas temperaturas pueden necesitar ajustes dependiendo del tipo de muestra. Consulte el manual del operador de ThermoBrite [55-005322].)
  3. Ajuste la temperatura de hibridación en 37 °C y el tiempo de hibridación en toda la noche (de 12 a 16 horas).
  4. Cuando el tiempo de hibridación haya finalizado, lave los portaobjetos siguiendo el procedimiento de lavado rápido descrito anteriormente.
  5. Deje los portaobjetos secar en oscuridad.
  6. Aplique 3 µl de tinción de contraste DAPI II a cada área diana del portaobjetos y ponga un cubreobjetos redondo de 12 mm.
 
 
 
 

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