Pretratamiento de muestras de parafina

Se han preparado de antemano portaobjetos con cortes de parafina y se han calentado a 56 °C. Usted continuará con el resto del protocolo de pretratamiento y después realizará hibridaciones con las sondas Her-2/neu / CEP® 17.

 

Desparafinación de portaobjetos

Hemo-De es un disolvente no tóxico con propiedades similares a las del xileno que se utiliza para disolver la parafina. El etanol deshidrata la muestra y solubiliza la parafina restante, por lo que resulta adecuado para el pretratamiento.

____ 1. Sumerja los portaobjetos en Hemo-De durante 10 minutos a temperatura ambiente.

____ 2. Repita este paso dos veces utilizando Hemo-De nuevo cada vez.

____ 3. Deshidrate los portaobjetos en EtOH al 100 % durante 5 minutos a temperatura ambiente.

____ 4. Repita el paso 3.

____ 5. Deje secar los portaobjetos al aire o colóquelos en un calentador de portaobjetos a 45-50 °C durante 2-5 minutos.

 

Pretratamiento de los portaobjetos

El HCl ayuda a solubilizar proteínas nucleares básicas, mejorando así la accesibilidad de las sondas al ADN. El HCl también se utiliza para extraer proteínas de la matriz extracelular que limitan la accesibilidad de la sonda a las células y provocan autofluorescencia del tejido. El tampón de pretratamiento ayuda a desnaturalizar las proteínas y a eliminar los entrecruzamientos entre las proteínas. Esto es importante para permitir una digestión suficiente de la proteasa.

____ 1. Sumerja los portaobjetos en HCl 0,2 N durante 20 minutos.

____ 2. Sumerja los portaobjetos en agua purificada durante 3 minutos.

____ 3. Sumerja los portaobjetos en tampón de lavado durante 3 minutos.

____ 4. Sumerja los portaobjetos en una solución de pretratamiento a 80 °C durante 30 minutos.

____ 5. Sumerja los portaobjetos en agua purificada durante 1 minuto.

____ 6. Sumerja los portaobjetos en tampón de lavado durante 5 minutos. Repita el procedimiento usando la segunda cubeta de tampón de lavado. 

 

Tratamiento de portaobjetos con proteasa

La proteasa sirve para digerir las proteínas tisulares y es esencial para la accesibilidad de las sondas al DNA diana.

____ 1. Retire los portaobjetos de la segunda cubeta de tampón de lavado y elimine el exceso de tampón secando los bordes de los portaobjetos sobre una toallita de papel.

____ 2. Sumerja los portaobjetos en una solución de proteasa a 37 °C durante 10 minutos.

____ 3. Sumerja los portaobjetos en tampón de lavado durante 5 minutos. Repita el procedimiento usando la segunda cubeta de tampón de lavado.

____ 4. Seque los portaobjetos en un calentador de portaobjetos a 45-50 °C durante 2-5 minutos.

 

Fijación de la muestra

La fijación de la muestra garantiza que la pérdida de tejido en la desnaturalización y la hibridación sea mínima.

____ 1. Sumerja los portaobjetos en formol tamponado al 10 % a temperatura ambiente durante 10 minutos.

____ 2. Sumerja los portaobjetos en tampón de lavado durante 5 minutos. Repita el procedimiento usando la segunda cubeta de tampón de lavado.

____ 3. Seque los portaobjetos en un calentador de portaobjetos a 45-50 °C durante 2-5 minutos. Continúe con el protocolo de la sonda Vysis LSI®.

 

Desnaturalización de la muestra

____ 1. Coloque los portaobjetos en la solución de desnaturalización precalentada a 72 ± 1 °C (<6/cubeta) durante 6 minutos.

____ 2. Deshidrátelos en EtOH al 70 %, 85 % y 100 % durante 1 minuto cada uno.

____ 3. Séquelos en un calentador a 45-50 °C durante 2-5 minutos.

 

Hibridación

____ 1. Precaliente la sonda a temperatura ambiente, agite en vórtex y centrifugue.

____ 2. Añada 10 ml de la mezcla de sondas en el área de muestras del portaobjetos.

____ 3. Coloque un cubreobjetos de 22 x 22 mm y selle los bordes con adhesivo de caucho.

____ 4. Coloque los portaobjetos en la cámara húmeda precalentada con una tapa hermética e introduzca la cámara en un incubador a 37 °C durante toda la noche (14-18 horas).

 

Lavado poshibridación

____ 1. Agregue tampón de lavado poshibridación a cada una de las dos cubetas tipo Coplin. Precaliente una cubeta en un baño de agua a 72 ± 1 °C y la segunda a temperatura ambiente.

____ 2. Retire el sello adhesivo de caucho del portaobjetos tirando suavemente del sellante con unas pinzas.

____ 3. Sumerja el portaobjetos en tampón de lavado poshibridación a temperatura ambiente y retire el cubreobjetos cuando flote.

____ 4. Retire el exceso de líquido apoyando el borde del portaobjetos sobre papel secante y sumérjalo en tampón de lavado poshibridación a 72 ± 1 °C durante 2 minutos (<6 portaobjetos/cubeta).

____ 5. Retire el/los portaobjetos del tampón de lavado, séquelos al aire en oscuridad y en posición vertical.

 

Tinción de contraste y conservación de los portaobjetos

____ 1. Aplique 10 ml de tinción de contraste DAPI al área diana del portaobjetos y coloque un cubreobjetos de vidrio. Conserve los portaobjetos en oscuridad antes de la enumeración de las señales. O consérvelos como se indica en el siguiente paso.

____ 2. Conserve los portaobjetos hibridados (con los cubreobjetos colocados) a -20 °C en oscuridad. Después de retirarlos del lugar donde estén guardado a -20 °C, deje que alcancen la temperatura ambiente antes de examinarlos al microscopio de fluorescencia.

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