Preparación de cuerpos polares humanos

Este procedimiento se realiza después de la extracción de cuerpos polares. Los cuerpos polares se biopsian a partir de ovocitos fecundados y no fecundados mediante disección mecánica.

Procedimiento

  1. Prepare el fijador (metanol:ácido acético glacial, 3:1) y guárdelo en el congelador hasta que esté listo para utilizarse.
  2. Prepare una cubeta tipo Coplin con metanol.
  3. Grabe un círculo pequeño en la parte inferior de una placa de Petri de 35 × 10 mm. El círculo identifica el área diana en la que se ha de colocar el cuerpo polar para una reubicación más fácil.
  4. Escriba la información de identificación de la muestra y otros datos pertinentes en el área esmerilada del portaobjetos de vidrio para microscopio. Limpie previamente el portaobjetos con fijador y un paño que no deje pelusa.
  5. Llene un portaobjetos excavado con agua purificada.
  6. Caliente la punta de una pipeta capilar de 25 µl con un microsoplete y, al mismo tiempo, tire de la punta calentada de la pipeta para extenderla y obtener una punta con un diámetro interior de 50 µm. Asegúrese de que la punta extendida de la pipeta presente una rotura uniforme para que no esté afilada. Una punta afilada puede dañar el cuerpo polar. Rompa la punta de nuevo si es necesario para obtener una punta lisa. Debe comprobarse el tamaño de la abertura de la pipeta antes de recoger el cuerpo polar para asegurarse de que tiene un tamaño adecuado; si el diámetro es demasiado grande, la posibilidad de que se pierda el cuerpo polar es mayor.
  7. Aspire una pequeña cantidad (aproximadamente de 2 a 3 µl) de agua en la pipeta.
  8. Por medio de un estereomicroscopio, localice el cuerpo polar en la placa de Petri.
  9. Aspire suavemente el cuerpo polar dentro de la pipeta y transfiéralo al portaobjetos excavado que contiene el agua. Libere el cuerpo polar de la pipeta soplando suavemente y colóquelo dentro del círculo central del portaobjetos excavado.
  10. Tome el cuerpo polar del agua aspirándolo junto con una pequeña cantidad de agua a la pipeta atenuada. Transfiera la célula a un portaobjetos de microscopio con una pequeña cantidad de agua. Grabe un círculo en la cara superior del portaobjetos, alrededor de la gota de agua con un marcador de carburo.
  11. Deje que el cuerpo polar se seque en la gota de agua sobre el portaobjetos mientras lo observa constantemente al microscopio invertido. Cuando esté seco, aspire una pequeña cantidad de fijador (aproximadamente de 2 a 3 µl) en la misma pipeta atenuada y deje caer el fijador sobre el cuerpo polar.

    Nota: Cuando fije los primeros cuerpos polares, 6 horas antes de su obtención, escurra el fijador antes del secado completo para eliminar todo el citoplasma.
  12. Coloque otra gota de fijador de la pipeta atenuada sobre la célula antes de que se seque por completo, a menos que la disolución del citoplasma sea evidente y ya se haya producido. Repita este proceso hasta que el citoplasma que rodea la célula se haya disuelto dejando solamente el núcleo (aplique fijador al menos 5 veces).

    Nota: La extracción completa del citoplasma es esencial para una hibridación óptima de la sonda.
  13. Con el punzón, trace dos círculos alrededor de la cromatina en la cara superior del portaobjetos de vidrio. Un círculo ha de ser ligeramente mayor que el otro; es decir, un círculo está dentro del otro con la célula en el centro del círculo más pequeño. El círculo grabado alrededor de la célula permitirá ubicar la célula más fácilmente después del procedimiento de hibridación.
  14. Coloque el portaobjetos en una cubeta tipo Coplin con metanol durante 5 minutos.
  15. Retire el portaobjetos del metanol y deje que se seque al aire.
  16. Usando la escala Vernier de la platina del microscopio, o un England Finder, localice y anote la ubicación de la célula en el portaobjetos de microscopio. Estas coordenadas facilitarán la ubicación de la célula después de la hibridación.
  17. Dibuje otro círculo más pequeño en la cara inferior del portaobjetos de microscopio alrededor de la célula utilizando un rotulador permanente. Esto define el área donde se debe aplicar la sonda.

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