Pretratamiento de parafina 3

 

La versión corta del protocolo no debe sustituir al prospecto.

Uso previsto
Para preparar cortes de tejido incluido en parafina fijados en portaobjetos con carga positiva para su uso en técnicas de hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas de ADN para FISH de varios colores Vysis. 

Resumen y principio
El siguiente procedimiento se ha diseñado para maximizar la procesabilidad y permeabilidad del tejido para la hibridación fluorescente in situ cuando se utilizan sondas de ADN para FISH de varios colores Vysis (por ejemplo, sonda ProVysionTM Multi-color, n.º de pedido 32-131090). Este ensayo de pretratamiento le ayudará a minimizar el fondo de partículas pesadas tras la hibridación con sondas de ADN, que a veces se puede producir en determinados tipos de tejidos.
paraffin-pretreatment-3-table.gif

Preparación de portaobjetos de muestras
Nota: Utilice muestras fijadas en formol durante 24-48 horas.

  1. Realice cortes de parafina de 4-5 µm de grosor con un microtomo.
  2.  Coloque los cortes flotando sobre un baño de agua purificada (por ejemplo, triple destilada) a 40 °C.
  3. Monte el corte sobre un portaobjetos con carga positiva.
  4. Deje los portaobjetos secar al aire y e incúbelos en una estufa a 56 °C durante toda la noche.

Desparafinación de portaobjetos

  1. Sumerja los portaobjetos en Hemo-De durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  2. Repita el paso 1 dos veces con Hemo-De nuevo cada vez.
  3. Deshidrate los portaobjetos en EtOH al 100 % durante 1 minuto a temperatura ambiente. Repita.
  4. Deje los portaobjetos secar al aire durante 2-5 minutos, si lo desea.

Pretratamiento de portaobjetos/con proteasa

  1. Sumerja los portaobjetos en ácido fórmico al 45 %/peróxido de hidrógeno al 0,3 % a temperatura ambiente durante 15 minutos.
  2. Sumerja los portaobjetos en agua purificada durante 3 minutos. Elimine el exceso de agua secando los bordes de los portaobjetos sobre una toallita de papel.
  3. Sumerja los portaobjetos en solución de pretratamiento a 80 °C durante 10 minutos.
  4. Lave en agua purificada nueva durante 3 minutos.
  5. Incube en una solución de trabajo de proteasa a 37 °C durante 10 minutos. Mida 50 ml (EXACTOS) de Protease Buffer III y coloque en un baño de agua a 37 ± 1 °C. Asegúrese de que la temperatura del tampón es de 37 ± 1 °C antes de su uso. Prepare la solución madre de proteasa añadiendo 9,0 mg (un tubo) de proteasa a 515 µl de agua purificada.

    Para preparar la solución de trabajo de proteasa
    Pipetee 100 µl de solución madre de proteasa en 50 ml (calentado y con el volumen cuidadosamente medido) de la botella de Protease Buffer III. Congele la solución madre de proteasa restante.
  6. Detenga la reacción mediante la incubación en solución de parada de proteasa durante 3 minutos.
  7. Lave los portaobjetos en agua purificada durante 3 minutos.
  8. Deje los portaobjetos secar al aire durante 2-5 minutos.
  9. Continúe con el protocolo de sonda Vysis correspondiente.

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