Pretratamiento de parafina 2

La versión corta del protocolo no debe sustituir al prospecto.

Uso previsto

Para preparar cortes de tejido incluido en parafina fijados en portaobjetos con carga positiva para su uso para hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas de ADN para FISH de varios colores Vysis.

Resumen y principio

El siguiente procedimiento se ha diseñado para maximizar la permeabilidad del tejido para FISH cuando se utilizan sondas de ADN para FISH de varios colores Vysis.

Reactivos suministrado en el kit   N.º de pedido del kit 32-801210    Para uso en laboratorio

Reactivo Cantidad Composición Conservación
Solución de pretratamiento 5 × 50 ml Tiocianato de sodio (NaSCN) De 2 a 25 °C
Protease Buffer II 5 × 62,5 ml HCl 0,2 N, pH 1,0 De 2 a 25 °C
Proteasa 5 × 250 mg 2500-3000 U/mg de proteasa, liofilizada De -20 a 8 °C

Materiales necesarios no suministrados

  • Etanol absoluto (EtOH)
  • Agente limpiador Hemo-De (Scientific Safety Solvents, n.º de cat. HD-150)
  • Agua purificada (destilada o desionizada)
  • Cubetas tipo Coplin (capacidad para 16 portaobjetos/8 ranuras)
  • Baños de agua a 37 °C y 80 °C (uno a 73 °C para el ensayo de la sonda)

 

Preparación de portaobjetos de muestras

Nota: Utilice muestras fijadas en formol durante 24-48 horas.

  1. Realice cortes de parafina de 4-5 µm de grosor con un microtomo.
  2. Coloque los cortes flotando sobre un baño de agua purificada (por ejemplo, triple destilada) a 40 °C.
  3. Monte un corte sobre un portaobjetos con carga positiva.
  4. Deje los portaobjetos secar al aire.
  5. Incube los portaobjetos en una estufa a 56 °C durante toda la noche.

 

Desparafinación de portaobjetos

  1. Sumerja los portaobjetos en Hemo-De durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  2. Repita el paso uno (1) dos veces con Hemo-De nuevo cada vez.
  3. Deshidrate los portaobjetos en EtOH al 100 % durante 1 minuto a temperatura ambiente. Repita.
  4. Deje los portaobjetos secar al aire durante 2-5 minutos, si lo desea.

 

Pretratamiento de portaobjetos

  1. Sumerja los portaobjetos en solución de pretratamiento a 80 °C durante 10 minutos. Si es necesario, se pueden colocar dos portaobjetos dorso contra dorso en cada ranura de la cubeta tipo Coplin, con un portaobjetos en cada extremo de la ranura. Para los portaobjetos del final, el lado del portaobjetos con el corte de tejido debe estar orientado hacia el centro de la cubeta.
  2. Sumerja los portaobjetos en agua purificada durante 3 minutos.

 

Pretratamiento con proteasa

  1. Retire los portaobjetos de la cubeta de agua purificada.
  2. Elimine el exceso de agua secando los bordes de los portaobjetos sobre una toallita de papel.
  3. Sumerja los portaobjetos en una solución de proteasa a 37 °C durante 15 minutos. (Asegúrese de que la temperatura del tampón es de 37 ± 1 °C antes añadir 250 mg de proteasa (un tubo). Si es necesario, se pueden colocar dos portaobjetos dorso contra dorso en cada ranura de la cubeta tipo Coplin, con un portaobjetos en cada extremo de la ranura. Para los portaobjetos del final, el lado del portaobjetos con el corte de tejido debe estar orientado hacia el centro de la cubeta.
  4. Sumerja los portaobjetos en agua purificada durante 3 minutos.
  5.  Deje los portaobjetos secar al aire durante 2-5 minutos.

 

Fijación de la muestra

Nota: La fijación de la muestra se realiza para minimizar la pérdida de tejido durante la desnaturalización de la muestra. Es muy recomendable el siguiente procedimiento cuando se lleva a cabo el procesamiento de muestras en un baño de desnaturalización.

  1. Llene una (1) cubeta tipo Coplin con 50 ml de formol tamponado al 10 %. Llene otras tres (3) cubetas tipo Coplin con 50 ml de etanol al 70 %, 85 % y 100 % en cada una.
  2. Sumerja los portaobjetos en formol tamponado al 10 % a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  3. Sumerja los portaobjetos en agua purificada durante 3 minutos.
  4. Deje los portaobjetos secar al aire.
  5. Continúe con el protocolo de sonda Vysis correspondiente.

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