Pretratamiento de parafina

La versión corta del protocolo no debe sustituir al prospecto.

Uso previsto

Para preparar cortes de tejido incluido en parafina fijados en portaobjetos con carga positiva para su uso para hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas para hibridación fluorescente in situ (FISH) de Vysis.

Reactivos proporcionados

Reactivo Cantidad Composición Conservación
Solución de pretratamiento 5 × 50 ml Tiocianato de sodio (NaSCN) De 2 a 25 °C
Tampón de proteasa 5 × 50 ml NaCl, pH 2,0 De 2 a 25 °C
Tampón de lavado 5 × 250 mg 2X SSC, pH 7,0 De 2 a 25 °C
Proteasa 5 × 25 mg 2500-3000 U/mg de proteasa, liofilizada -20 °C

Preparación de portaobjetos de muestras (opcional)

Nota: Utilice muestras fijadas en formol durante 24-48 horas.

  1. Realice cortes de parafina de 4-5 µm de grosor con un microtomo.
  2. Coloque los cortes flotando sobre un baño de agua purificada (por ejemplo, triple destilada) a 40 °C.
  3. Monte un corte sobre un portaobjetos con carga positiva.
  4. Deje los portaobjetos secar al aire.
  5. Incube los portaobjetos en una estufa a 56 °C durante toda la noche.

Desparafinación de portaobjetos

  1. Sumerja los portaobjetos en Hemo-De durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  2. Repita el paso 1 dos veces con Hemo-De nuevo cada vez.
  3. Deshidrate los portaobjetos en EtOH al 100 % durante 5 minutos a temperatura ambiente. Repita.
  4. Deje secar los portaobjetos al aire o colóquelos en un calentador de portaobjetos a 45-50 °C durante 2-5 minutos.

Pretratamiento de los portaobjetos

  1. Sumerja los portaobjetos en HCl 0,2 N durante 20 minutos.
  2. Sumerja los portaobjetos en agua purificada durante 3 minutos.
  3. Sumerja los portaobjetos en tampón de lavado durante 3 minutos.
  4. Sumerja los portaobjetos en solución de pretratamiento a 80 °C durante 30 minutos. Se pueden colocar dos portaobjetos dorso contra dorso en cada ranura de la cubeta tipo Coplin, con un portaobjetos en cada extremo de la ranura. Para los portaobjetos del final, el lado del portaobjetos con el corte de tejido debe estar orientado hacia el centro de la cubeta. 
  5. Sumerja los portaobjetos en agua purificada durante 1 minuto.
  6. Sumerja los portaobjetos en tampón de lavado durante 5 minutos. Repita el procedimiento usando la segunda cubeta de tampón de lavado.

Tratamiento de portaobjetos con proteasa

  1. Retire los portaobjetos de la segunda cubeta de tampón de lavado.
  2. Elimine el exceso de tampón secando los bordes de los portaobjetos sobre una toallita de papel.
  3. Sumerja los portaobjetos en una solución de proteasa a 37 °C durante 10 minutos. (Asegúrese de que la temperatura del tampón es de 37 ± 1 °C antes añadir 25 mg de proteasa (un tubo).
  4. Sumerja los portaobjetos en tampón de lavado durante 5 minutos. Repita el procedimiento usando la segunda cubeta de tampón de lavado.
  5. Seque los portaobjetos en un calentador de portaobjetos a 45-50 °C durante 2-5 minutos.

Fijación de la muestra

  1. Sumerja los portaobjetos en formol tamponado al 10 % a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  2. Sumerja los portaobjetos en tampón de lavado durante 5 minutos. Repita el procedimiento usando la segunda cubeta de tampón de lavado.
  3. Seque los portaobjetos en un calentador de portaobjetos a 45-50 °C durante 2-5 minutos.
  4. Continúe con el protocolo de sonda Vysis correspondiente.

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