Preparación de linfocitos: Preparación del cultivo

Preparación de linfocitos: Preparación del cultivo
  1. Extraiga 8-10 ml de sangre periférica en un tubo Vacutainer de 10 ml con tapón verde que contenga heparina sódica como conservante. Mezcle bien.
  2. Transfiera asépticamente el contenido del tubo Vacutainer a un tubo de centrífuga de 15 ml.
  3. Centrifugar la muestra a 2000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga de sobremesa.
  4. Retire cuidadosamente la capa de plasma con una pipeta Pasteur. Deseche la capa de plasma siguiendo el procedimiento de su laboratorio para la eliminación de material biológico.
  5. Retire la capa leucocítica aspirando los leucocitos con una pipeta Pasteur con un suave movimiento circular. También se aspirarán algunos eritrocitos y plasma; procure incluir el mínimo número de eritrocitos.
  6. Ponga la capa leucocítica en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 1,5 ml de cRPMI.
  7. Haga alícuotas de un volumen apropiado de la suspensión de leucocitos en matraces de cultivo de 25 cm2 que contengan 10 ml de cRPMI. 
  8. Añada 0,2 ml de PHA a cada matraz; apriete bien el tapón y luego aflójelo ligeramente para permitir la entrada de CO2 en el matraz.
  9. Incube el cultivo:

para usarlo en la preparación de portaobjetos para FISH...

Este método produce cromosomas con una resolución de banda de 400-450 y es suficiente para la mayoría de las aplicaciones de FISH. 

    • Incube el cultivo a 37 ± 1 °C, en CO2 al 5 % durante 72-96 horas.

para usarlo en la preparación de portaobjetos para CGH...

Estos pasos adicionales aumentan la elongación de los cromosomas y el índice mitótico. Para CGH, los cromosomas deben tener una resolución de banda de 400-550.

    • Incube el cultivo a 37 ± 1 °C, en CO2 al 5 % durante 48-72 horas.
    • Añada 0,2 ml de solución de timidina en cada matraz de cultivo y mezcle suavemente.
    • Incube el cultivo durante 14-18 horas.
    • Transfiera el cultivo a un tubo de centrífuga de 15 ml.
    • Centrifugue a 1000 rpm durante 10 minutos.
    • Decante el sobrenadante y añada 10 ml de PBS.
    • Centrifugue a 1000 rpm durante 10 minutos.
    • Decante el sobrenadante y añada 10 ml de cRPMI en cada tubo.
    • Incube el cultivo durante 4-5 horas.
 
 
 
 
Recolección del cultivo
  1. Extraiga 8-10 ml de sangre periférica en un tubo Vacutainer de 10 ml con tapón verde que contenga heparina sódica como conservante. Mezcle bien.
  2. Transfiera asépticamente el contenido del tubo Vacutainer a un tubo de centrífuga de 15 ml.
  3. Centrifugar la muestra a 2000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga de sobremesa.
  4. Retire cuidadosamente la capa de plasma con una pipeta Pasteur. Deseche la capa de plasma siguiendo el procedimiento de su laboratorio para la eliminación de material biológico.
  5. Retire la capa leucocítica aspirando los leucocitos con una pipeta Pasteur con un suave movimiento circular. También se aspirarán algunos eritrocitos y plasma; procure incluir el mínimo número de eritrocitos.
  6. Ponga la capa leucocítica en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 1,5 ml de cRPMI.
  7. Haga alícuotas de un volumen apropiado de la suspensión de leucocitos en matraces de cultivo de 25 cm2 que contengan 10 ml de cRPMI.
  8. Añada 0,2 ml de PHA a cada matraz; apriete bien el tapón y luego aflójelo ligeramente para permitir la entrada de CO2 en el matraz.
  9. Incube el cultivo:

para usarlo en la preparación de portaobjetos para FISH...

Este método produce cromosomas con una resolución de banda de 400-450 y es suficiente para la mayoría de las aplicaciones de FISH. 

    • Incube el cultivo a 37 ± 1 °C, en CO2 al 5 % durante 72-96 horas.

para usarlo en la preparación de portaobjetos para CGH... 

Estos pasos adicionales aumentan la elongación de los cromosomas y el índice mitótico. Para CGH, los cromosomas deben tener una resolución de banda de 400-550.

    • Incube el cultivo a 37 ± 1 °C, en CO2 al 5 % durante 48-72 horas.
    • Añada 0,2 ml de solución de timidina en cada matraz de cultivo y mezcle suavemente.
    • Incube el cultivo durante 14-18 horas.
    • Transfiera el cultivo a un tubo de centrífuga de 15 ml.
    • Centrifugue a 1000 rpm durante 10 minutos.
    • Decante el sobrenadante y añada 10 ml de PBS.
    • Centrifugue a 1000 rpm durante 10 minutos.
    • Decante el sobrenadante y añada 10 ml de cRPMI en cada tubo.
    • Incube el cultivo durante 4-5 horas. 
 
 
 
 
Fijación de la muestra
  1. Añada lentamente 2 ml de fijador de Carnoy en el interior de cada tubo de centrífuga.
  2. Golpee suavemente el tubo de centrífuga para mezclar la suspensión del pellet de células con el fijador.
  3. Añada lentamente otros 6 ml de fijador de Carnoy en cada tubo.
  4. Tape herméticamente cada tubo e inviértalo varias veces para mezclar. 
  5. Deje reposar la suspensión durante 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugue a 1000 rpm durante 10 minutos.
  6. Aspire el sobrenadante hasta la marca de 1,5 ml del tubo de centrífuga, evitando el pellet de células.
  7. Golpee suavemente el tubo de centrífuga para disociar el pellet.
  8. Realice los siguientes pasos tres veces:
    • Añada lentamente 10 ml de fijador de Carnoy en cada tubo de centrífuga.
    • Tape herméticamente cada tubo e inviértalo para mezclar. 
    • Centrifugue la suspensión a 1000 rpm durante 10 minutos.
    • Aspire el sobrenadante hasta la marca de 1,5 ml del tubo de centrífuga, evitando el pellet de células.
    • Golpee suavemente el tubo de centrífuga para disociar el pellet.
  9. Añada lentamente fijador de Carnoy a cada suspensión para producir una suspensión ligeramente turbia y mezcle con suavidad.

 

Nota: Se añade fijador al pellet de células hasta que la suspensión está ligeramente turbia; la cantidad de fijador necesaria dependerá del tamaño del pellet. 

 

Las células pueden conservarse a 4 °C en un tubo de centrífuga herméticamente cerrado hasta que estén listas para utilizarse. Si los portaobjetos no se preparan en un plazo de 7 DÍAS, eleve el volumen total a 10 ml y guárdelo a -20 °C. Repita el lavado descrito en los pasos 8a-8e dos veces antes de preparar los portaobjetos.

 
 
 
 

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