FISH en preparaciones teñidas con PAP: Preparación de soluciones

FISH en preparaciones teñidas con PAP: Preparación de soluciones
  • Prepare una solución madre de pepsina. Consérvela congelada. Disuelva 0,5 g de pepsina en 5 ml de agua destilada. La concentración de pepsina es de 100 mg/ml.
  • Prepare una solución de trabajo de pepsina (0,05 mg/ml). Añada 20 µl de solución madre de pepsina a 40 ml de HCl 10 mM. La concentración final de pepsina es de 0,05 mg/ml.
  • Solución fijadora de formaldehído al 1 % (V = 400 ml). Mezcle 10 ml de formaldehído al 37 % con 386 ml de PBSx1 y 4 ml de 100xMgCl2 100xMgCl2 = MgCl2 2 M. Conserve la mezcla en el frigorífico. Deséchela después de cada uso. Deseche la solución después de cada uso.
 
 
 
 
Retirada del cubreobjetos
  1. Sumerja los portaobjetos en xileno durante aproximadamente 48 horas a temperatura ambiente o hasta que los cubreobjetos se puedan retirar fácilmente o se caigan de los portaobjetos.
  2. Lave los portaobjetos en xileno nuevo durante 5 minutos. Se recomienda realizar el tercer lavado de xileno con una solución nueva durante 5 minutos.
  3. Deje los portaobjetos secar al aire durante aproximadamente 15 minutos.
  4. Coloque los portaobjetos en una cubeta tipo Coplin con etanol al 95 %. Se pueden almacenar durante varios días o semanas en el frigorífico.
  5. Lave los portaobjetos en una cubeta tipo Coplin primero con etanol al 85 % y, a continuación, con etanol al 70 %, durante 5 minutos cada lavado.
  6. Incube los portaobjetos en 2xSSC durante 15-60 minutos. Continúe con el pretratamiento y después con el procedimiento de FISH.
 
 
 
 
Procedimiento de pretratamiento
  1. Incube los portaobjetos en 2xSSC a 37 °C durante 10 minutos.
  2. Incube los portaobjetos en solución de trabajo de pepsina a 37 °C durante 13 minutos.
  3. Incube en PBSx1 durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  4. Fije los portaobjetos en formaldehído al 1 % durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  5. Lave el portaobjetos en PBSx1 durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  6. Proceda con la desnaturalización del portaobjetos según el protocolo de FISH.
 
 
 
 

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