Pretratamiento para FISH

La versión corta del protocolo no debe sustituir al prospecto.

Uso previsto

Preparar células fijadas sobre portaobjetos para su uso en hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas Vysis.

Reactivos proporcionados

Reactivo Cantidad Composición Conservación
Tampón de pepsina 3 × 50 ml 10 mM HCl De 2 a 25 °C
Proteasa 3 × 25 mg 2500-3000 U/mg de proteasa, liofilizada De -20 a 8 °C
PBS 2 × 250 ml  1X PBS De 2 a 25 °C
100X MgCl2 3 × 0,5 ml 2M MgCl2 * 6 H2O De 2 a 25 °C
20X SSC 1 × 66 g Cloruro sódico y citrato sódico De -25 a 30 °C

Reactivos proporcionados
Materiales necesarios no suministrados

  • Etanol absoluto (EtOH)
  • Solución tamponada de formol al 10 %
  • Fijador de Carnoy (metanol: ácido acético glacial [3:1])
  • Agua purificada (destilada o desionizada)
  • Cubetas tipo Coplin
  • Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml
  • Tubos de microcentrífuga de prolipropileno (1,5 ml)
  • Baño de agua a 37 °C

 

Procedimiento de pretratamiento

  1. Deje que los portaobjetos se sequen completamente a temperatura ambiente.
  2. Sumerja los portaobjetos en 2X SSC durante 2 minutos a 73 ± 1 °C.
  3. Sumerja los portaobjetos en una solución de proteasa durante 10 minutos a 37 °C. (Asegúrese de que la temperatura del tampón es de 37 °C antes de añadir los 25 mg [un tubo] de proteasa).
  4. Lave los portaobjetos en 1X PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  5. Fije los portaobjetos en formaldehído al 1 % durante 5 minutos a temperatura ambiente. (Mezcle 12,5 ml de formol tamponado neutro al 10 %, 37 ml de 1X PBS y 0,5 ml de 100X MgCl2 (un tubo).
  6. Lave los portaobjetos en 1X PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  7. Deshidrate los portaobjetos por inmersión en una solución de etanol al 70 % a temperatura ambiente. Deje los portaobjetos en el lavado de etanol durante 1 minuto. Repita con etanol al 85 % y, a continuación, con etanol al 100 %.
  8. Continúe con el protocolo de sonda Vysis correspondiente.

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