FISH en núcleos aislados a partir de parafina

  • Útil para muestras fijadas durante largos periodos de tiempo o aquellas que resultan difíciles de usar como dianas de FISH, como muestras de cerebro.
  • Desparafine un corte de tejido de 40 µm con xileno (o Histoclear) 3 veces durante 10 minutos cada muestra.
  • Deshidrate en EtOH al 100 % 2 veces durante 5 minutos cada muestra.
  • Incube en 4 mg/ml de pepsina (Sigma P-7012, en NaCl al 0,9 %, pH 1,5), durante 2 horas a 37 °C. Agite en el vórtex cada 30 minutos.
  • Filtre a través de un filtro de nailon con un poro de 40 µm.
  • Centrifugue a 800 rpm (equipo de sobremesa estándar) entre 5 y 10 minutos.
  • Lave el pellet en PBS, centrifugue 2 veces a 800 rpm durante 5-10 minutos cada muestra.
  • Resuspenda el pellet en un volumen mínimo de PBS.
  • Agite en el vórtex los núcleos y extiéndalos sobre portaobjetos FISHer Superfrost Plus (n.º de cat. 12-550-15) y seque los portaobjetos a 65 °C durante 10 minutos.
  • Lave el portaobjetos en PBS.
  • Incube en Triton 100 al 0,01 % en PBS durante 1,5 minutos.
  • Lave 3 veces en PBS durante 3 minutos cada muestra.
  • Incube durante 5 minutos en 0,3 mg/ml de pronasa en Tris 50 mM/Cl pH 7,6, EDTA 5 mM.
  • Incube en 2 mg/ml de glicina en PBS 3 veces durante 3 minutos cada muestra.
  • Incube durante 5 minutos en paraformaldehído al 4 % en PBS.
  • Incube durante 3 minutos en 2 mg/ml de glicina en PBS.
  • Lave en EtOH al 30 %, 60 %, 80 %, 95 % y 100 % durante 3 minutos cada muestra.
  • Deje los portaobjetos secar al aire.
  • Desnaturalice la sonda y el ADN diana de forma simultánea durante 1-3 minutos en un horno a 90 °C.
  • Incube a 37 °C en una cámara húmeda durante al menos 1 hora o toda la noche.
  • Lave durante 1 minuto cada muestra en las siguientes soluciones de lavado a 45 °C: 3 x formamida al 50 %/2X SSC, un lavado de cada muestra en 2X SSC, 2X SSC/0,1 % NP-40, 2X SSC/0,1 % NP-40 (RT)
  • Este protocolo exige formamida y xileno, que son teratógenos. Consulte la ficha técnica de seguridad correspondiente para obtener más información.

 

Protocolo enviado por:

Dr. Rizwan Naaem - Director del Laboratorio de Citogenética

Baystate Medical Center, Springfield, MA 1994 (EE. UU.)

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