FISH en núcleos aislados a partir de parafina

  • Útil para muestras fijadas durante largos periodos de tiempo o aquellas que resultan difíciles de usar como dianas de FISH, como muestras de cerebro.
  • Desparafine un corte de tejido de 40 µm con xileno (o Histoclear) 3 veces durante 10 minutos cada muestra.
  • Deshidrate en EtOH al 100 % 2 veces durante 5 minutos cada muestra.
  • Incube en 4 mg/ml de pepsina (Sigma P-7012, en NaCl al 0,9 %, pH 1,5), durante 2 horas a 37 °C. Agite en el vórtex cada 30 minutos.
  • Filtre a través de un filtro de nailon con un poro de 40 µm.
  • Centrifugue a 800 rpm (equipo de sobremesa estándar) entre 5 y 10 minutos.
  • Lave el pellet en PBS, centrifugue 2 veces a 800 rpm durante 5-10 minutos cada muestra.
  • Resuspenda el pellet en un volumen mínimo de PBS.
  • Agite en el vórtex los núcleos y extiéndalos sobre portaobjetos FISHer Superfrost Plus (n.º de cat. 12-550-15) y seque los portaobjetos a 65 °C durante 10 minutos.
  • Lave el portaobjetos en PBS.
  • Incube en Triton 100 al 0,01 % en PBS durante 1,5 minutos.
  • Lave 3 veces en PBS durante 3 minutos cada muestra.
  • Incube durante 5 minutos en 0,3 mg/ml de pronasa en Tris 50 mM/Cl pH 7,6, EDTA 5 mM.
  • Incube en 2 mg/ml de glicina en PBS 3 veces durante 3 minutos cada muestra.
  • Incube durante 5 minutos en paraformaldehído al 4 % en PBS.
  • Incube durante 3 minutos en 2 mg/ml de glicina en PBS.
  • Lave en EtOH al 30 %, 60 %, 80 %, 95 % y 100 % durante 3 minutos cada muestra.
  • Deje los portaobjetos secar al aire.
  • Desnaturalice la sonda y el ADN diana de forma simultánea durante 1-3 minutos en un horno a 90 °C.
  • Incube a 37 °C en una cámara húmeda durante al menos 1 hora o toda la noche.
  • Lave durante 1 minuto cada muestra en las siguientes soluciones de lavado a 45 °C: 3 x formamida al 50 %/2X SSC, un lavado de cada muestra en 2X SSC, 2X SSC/0,1 % NP-40, 2X SSC/0,1 % NP-40 (RT)
  • Este protocolo exige formamida y xileno, que son teratógenos. Consulte la ficha técnica de seguridad correspondiente para obtener más información.

 

Protocolo enviado por:

Dr. Rizwan Naaem - Director del Laboratorio de Citogenética

Baystate Medical Center, Springfield, MA 1994 (EE. UU.)

Está a punto de abandonar un sitio web de Abbott para dirigirse a un sitio web de otro proveedor

Los enlaces que le remiten a sitios web que no forman parte de Abbott no se encuentran bajo el control de Abbott. Abbott no es responsable del contenido de ninguno de estos sitios ni de los enlaces incluidos en ellos. Abbott pone a su disposición estos enlaces solamente para su comodidad, y la inclusión de estos no implica la aprobación por parte de Abbott del sitio web al que dirigen. Es posible que el sitio web al que va a acceder no esté optimizado para el tamaño de su pantalla.

¿Desea continuar y salir de este sitio web?

No

Va a acceder a un sitio web de Abbott específico de un país o región.

Tenga en cuenta que el sitio web al que ha solicitado acceso está destinado a los residentes de un país o países determinados, como se indica en ese sitio. Por tanto, el sitio puede contener información sobre productos farmacéuticos, dispositivos médicos y otros productos o sobre el uso de esos productos que no estén aprobados en otros países o regiones.

¿Desea continuar y acceder a este sitio web?

No

Va a acceder a un sitio web de Abbott específico de un país o región.

Tenga en cuenta que el sitio web al que ha solicitado acceso está destinado a los residentes de un país o países determinados, como se indica en ese sitio. Por tanto, el sitio puede contener información sobre productos farmacéuticos, dispositivos médicos y otros productos o sobre el uso de esos productos que no estén aprobados en otros países o regiones.

¿Desea continuar y acceder a este sitio web?

No