Control de calidad del laboratorio de FISH

Estas directrices se redactaron originalmente para el producto de portaobjetos de control ProbeChek™, pero son un excelente punto de partida para el establecimiento de procedimientos de laboratorio de calidad utilizando sondas CEP® o LSI® para la enumeración.

Los procedimientos de hibridación de sondas CEP o LSI se deben seguir tal como se indica en el prospecto del producto proporcionado con la sonda. Se recomienda encarecidamente el uso de procedimientos, filtros y equipos para microscopio de fluorescencia con un rendimiento óptimo, tal como se indica en los prospectos de las sondas, para llevar a cabo una hibridación óptima y una correcta evaluación e interpretación de las señales de las sonda CEP y LSI utilizando los controles ProbeChek™. Las muestras se deben evaluar con un microscopio de contraste de fase antes de la hibridación para determinar si son óptimas para FISH. A continuación se indican las directrices recomendadas para los portaobjetos para FISH:

  • Las células se deben distribuir uniformemente por todo el portaobjetos. Las áreas de aglutinación celular indican una mala preparación del portaobjetos o de la muestra. Debe haber un mínimo de ocho células por campo 400X (aumento total). Un menor número de células indica que la concentración celular es demasiado baja para una enumeración óptima. 
  • Los núcleos y los cromosomas en metafase no deben estar en fase brillante. La presencia de células en fase brillante indica que las condiciones de preparación del portaobjetos no han sido óptimas. Optimice siempre las condiciones de preparación de los portaobjetos con una preparación de linfocitos de buena calidad antes de la preparación de los portaobjetos.
  • No debe apreciarse citoplasma alrededor de los núcleos y las metafases. El citoplasma puede impedir la hibridación, además de provocar una hibridación poco eficaz y resultados inexactos.

Los portaobjetos hibridados se deben evaluar según los parámetros de calidad determinados por el laboratorio. Con un juego de filtros, una iluminación y un microscopio adecuados, se deben evaluar la especificidad de la hibridación, la intensidad de señal de la sonda y el ruido de fondo de la señal para determinar si la hibridación es óptima para el análisis. Al menos el 85 % de todos los núcleos del área diana deben ser fácilmente enumerables. Debe haber un "ruido" fluorescente nuclear o de fondo mínimo. Las señales de la sonda deben ser fácilmente visibles usando un aumento mínimo de 400X. La mayoría de los núcleos de la preparación de los portaobjetos deben estar disociados de los núcleos circundantes y no deben estar cubiertos por citoplasma. La presencia de numerosas áreas de núcleos agrupados (más de 3 núcleos juntos) puede impedir la distribución adecuada y homogénea de los núcleos para una enumeración exacta. Las preparaciones que no satisfagan estos criterios no se deben usar para la enumeración de señales. La enumeración de señales se debe realizar de forma individual para cada sonda en evaluación; sin embargo, es razonable enumerar las sondas CEP X y CEP Y simultáneamente.

 

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Formato de documentación recomendada para la preparación de portaobjetos y el control de calidad de la hibridación in situ.

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