Conceptos básicos sobre filtros y microscopios

Conceptos básicos sobre filtros y microscopios

La amplia variedad de juegos de filtros paso-banda único, doble y triple de Abbott Molecular permite la visualización de alto contraste y claramente definida de los reactivos de Abbott Molecular. Al permitir la visualización simultánea de hasta cinco fluoróforos diferentes, los juegos de filtros de varios paso-banda mejoran la utilidad de los procedimientos de hibridación fluorescente in situ (FISH), lo que permite obtener varios resultados al mismo tiempo a partir de un único ensayo. Cada juego de filtros se ha diseñado y optimizado para su uso con fluoróforos de Abbott Molecular. Hay juegos de filtros de Abbott Molecular disponibles para los modelos de microscopios más habituales, que incluyen:

  • Olympus®
  • Zeiss®
  • Leitz/Leica®
  • Nikon® 
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Conceptos básicos sobre microscopía

Un microscopio de fluorescencia correctamente configurado y bien conservado es esencial para la obtención de unos resultados de FISH óptimos. Asegúrese de seguir atentamente las instrucciones del fabricante durante el funcionamiento y el cuidado de su microscopio.

 
 
 
 
Fuente de lámpara de excitación

La lámpara de excitación es la fuente de luz que excita los fluoróforos para que emitan una señal de fluorescencia. Las dos características principales de una fuente de excitación son espectros de emisión e intensidad. La lámpara debe emitir dentro de los picos de absorción de los fluoróforos determinados para provocar la fluorescencia. Cuanto más fuerte sea la intensidad de excitación, más brillante será la fluorescencia. Sin embargo, cuanto más brillante sea la intensidad de excitación, más rápida será la fotooxidación o decoloración de la fluoróforos. Durante la elección de la lámpara se deben tener en cuenta las compensaciones entre el brillo de la imagen que se va a revisar y la cantidad de tiempo que va a permanecer visible. Vysis recomienda el uso de una fuente de lámpara de excitación de mercurio de 100 vatios.

 
 
 
 
Objetivos recomendados para la hibridación in situ
  • Planifique objetivos optimizados para microscopía de fluorescencia; alta apertura numérica (~1,3)
  • Objetivos con el menor número de elementos de lente; apertura numérica > o = 0,75
  • No se recomiendan objetivos con muchos elementos de lente; apertura numérica > o = 0,75

 

 
 
 
 
Juegos de filtros

Los juegos de filtros están diseñados para la visualización de un fluoróforo específico o una combinación específica de dos o más fluoróforos. Un juego de filtros para microscopía de fluorescencia se compone de tres elementos: un filtro de excitación para seleccionar las longitudes de onda utilizadas para excitar el fluoróforo; un espejo dicroico (divisor de haz o policroico) para reflejar la luz de excitación hasta el objeto del portaobjetos, bloqueando gran parte de la luz de excitación reflejada desde el portaobjetos al ocular dejando pasar la luz emitida desde el fluoróforo en la hibridación in situ; y un filtro de emisión final (filtro de barrera) para dejar pasar solo la luz emitida desde el fluoróforo mientras se bloquean las demás longitudes de onda fuera del rango especificado.

 
 
 
 
Fluoróforo único

Juegos de filtros

Los filtros se dividen en tres clases principales: paso-banda, paso largo o paso corto. Un filtro paso-banda transmite las longitudes de onda dentro de una región de longitudes de onda posicionando el "límite inferior" en una longitud de onda baja y el "límite superior" en una longitud de onda más elevada. Las longitudes de onda se bloquean por debajo del límite inferior o por encima del límite superior mediante absorción y/o reflexión. El paso-banda o el ancho de banda (BW, bandwidth) es la anchura del pico en nanómetros (nm) al 50 % de la transmisión máxima para un pico determinado. También se puede denominar ancho total a media altura (FWHM, full width half maximum) o ancho de banda a media potencia (HPBW, half power bandwidth). Un filtro paso largo transmite las longitudes de onda situadas por encima de un valor determinado y bloquea las longitudes de onda situadas por debajo de dicho valor.

 

Un filtro paso corto hace lo opuesto al paso largo y, por tanto, transmite las longitudes de onda situadas por debajo de un valor determinado y bloquea las longitudes de onda situadas por encima de dicho valor. Los filtros de interferencia se fabrican mediante deposición al vacío de finas láminas sobre un sustrato de vidrio. Las finas láminas se componen de capas alternas de metal o dieléctrico con índices de refracción altos y bajos. Los filtros de interferencia se pueden diseñar para que sean filtros paso-banda, paso largo o paso corto. Los filtros de vidrio de colores se fabrican con vidrio impregnado de colorante y generalmente son filtros paso-banda o paso largo. Los filtros pueden contener varios elementos de vidrio coloreado y/o de tipo interferencia, apilados y pegados entre sí con resina epoxi óptica (laminada). Si un filtro contiene cualquier elemento de interferencia se denomina filtro de interferencia.

 

Los filtros de interferencia son muy aconsejables por su ancho de banda estrecho, su elevada eficiencia de transmisión y sus límites superiores e inferiores extremadamente marcados. Estos filtros son más caros y menos duraderos y, generalmente, tienen mayor señal/ruido (S/N) que los filtros de vidrio coloreado. Los filtros de vidrio coloreado generalmente tienen un ancho de banda amplio (p. ej., 40 nm para el excitador FITC), una menor eficiencia de transmisión y límites superiores e inferiores finales. Los filtros de vidrio coloreado se utilizan porque están fácilmente disponibles, son más baratos y más duraderos. 

 

Los filtros de excitación suelen ser filtros paso-banda. Los filtros de excitación pueden ser de vidrio coloreado o de tipo interferencia. Cuanto mayor sea el ancho de banda, mayor será la energía de excitación. A medida que aumenta el ancho de banda, aumenta la intensidad de emisión, pero existe una mayor probabilidad de que se genere autofluorescencia inespecífica.

 

Los dicroicos son filtros de interferencia. Los filtros dicroicos se fabrican con tecnología de finas láminas, pero dado que necesitan seguir siendo finas para que la calidad de imagen sea elevada, no se protegen con vidrio de protección laminado. Los dicroicos sin protección se pueden rayar y dañar fácilmente. Con los filtros Zeiss Axioline, el usuario debe tener cuidado durante el montaje de los juegos de filtros y manipular el dicroico únicamente por los bordes y con guantes.

 

Los filtros de emisión pueden ser paso-banda o paso largo.

 

Los filtros de emisión pueden ser de vidrio coloreado o de tipo interferencia. Los filtros paso largo dejan pasar más luz, cuyo resultado son imágenes más brillantes pero con más fondo y menos señal/ruido (S/N). Este aumento del ruido y del fondo es consecuencia de los restos celulares, el propio portaobjetos del microscopio, etc.

 
 
 
 

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