Nick translation para CGH: Preparación de reactivos

Nick translation para CGH: Preparación de reactivos

 

dUTP SpectrumGreen o SpectrumRed 0,2 mM

Añada 10 µl de dUTP 1 mM a 40 µl de agua sin nucleasas.

 

dTTP 0,1 mM

Añada 10 µl de dTTP 0,3 mM a 20 µl de agua sin nucleasas.

 

Mezcla de dNTP 0,1 mM

Mezcle 10 µl de dATP 0,3 mM, dCTP 0,3 mM y dGTP 0,3 mM.

 

ADN genómico extraído

Prepare una solución de 0,2 µg/µl a 1 µg/µl de ADN genómico extraído en tampón Tris-EDTA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,5).

 
 
 
 
Nick translation para CGH: Procedimiento de ensayo

 

Este procedimiento marca aproximadamente 1 µg de ADN genómico extraído. Es cantidad suficiente para cinco hibridaciones CGH.

  1. Coloque un tubo de microcentrífuga en hielo y deje que se enfríe.
  2. Añada estos componentes al tubo en el orden que se indica a continuación:
    cgh-nick-translation-assay-procedure.gif
  3. Agite el tubo en el vórtex brevemente.
  4. Incube 2-4 horas a 15 °C.
  5. Detenga la reacción calentándola en un baño de agua a 70 °C durante 10 minutos.
  6. Enfríe en hielo. 

Determinación del tamaño de la sonda

La determinación del tamaño de la sonda es una parte esencial del procedimiento de CGH. Para obtener instrucciones detalladas sobre la preparación y desarrollo de un gel de agarosa, consulte (1) Maniatis T, Fritsch EF y Sambrook J. Gel electrophoresis of DNA. En: Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring, NY: Cold Spring Harbor Laboratory; 1989 o (2) Ausubel FM, ed. Preparation and Analysis of DNA. En: Current Protocols in Molecular Biology. Nueva York: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, 1989.

  1. Prepare un gel de agarosa al 1 % añadiendo 1 g de agarosa a 100 ml de tampón TAE. Caliente la solución en el microondas hasta que la agarosa se funda. Este volumen es suficiente para tres minigeles.
  2. Enfríe la solución de agarosa hasta 55 °C y añada 10 µl de EtBr (la concentración final es de 0,01 % [v/v]).
  3. Vierta la agarosa fundida en el aparato de minigeles (10 cm x 6,5 cm) con peines. Deje enfriar la agarosa hasta que solidifique.
  4. Vierta suficiente tampón de migración TAE en el aparato de minigeles hasta cubrir el gel aproximadamente 1 mm.
  5. Tome 9 µl de la mezcla de reacción que contiene el ADN fruto de la reacción de nick translation y añada 1 µl de tampón de carga.
  6. Desarrolle la muestra en un carril y una muestra del marcador de tamaño de ADN en otro carril para medir el tamaño de la sonda.
  7. Realice la electroforesis del gel a 10 V/cm hasta que el colorante del tampón de carga esté a 2-3 cm del final del gel.
  8. Calcule el rango de tamaños de la sonda a partir del gel. La mayoría del barrido ("smear") de ADN debe estar comprendido dentro del rango de 300 a 3000 pb. Los fragmentos de sonda de mayor tamaño proporcionarán una intensidad de fluorescencia atenuada cuando se utilicen en un análisis de CGH. 

A medida que aumente la cantidad de enzima y el tiempo de incubación, la distribución de tamaños cambia a fragmentos de sonda cada vez más pequeños. Para producir fragmentos de sonda más pequeños utilice las condiciones que se especifican a continuación para reducir el tamaño de fragmento: 5 µl de mezcla de enzima/2 horas de incubación, 5 µl de mezcla de enzima/4 horas de incubación, 10 µl de mezcla de enzima/2 horas de incubación y 10 µl de mezcla de enzima/4 horas de incubación. Ajuste la cantidad añadida de agua sin nucleasas para mantener el volumen total de reacción en 50 µl.

 
 
 
 

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