Hibridación CGH: Preparación de reactivos

Hibridación CGH: Preparación de reactivos

20X SSC, pH 5,3

Mezcle bien 66 g de 20X SSC con 200 ml de H2O purificada. Ajuste a pH 5,3 a temperatura ambiente utilizando HCl concentrado y cantidad suficiente hasta un volumen final de 250 ml. Conserve la mezcla a temperatura ambiente. Deseche la solución madre después de 6 meses o antes si parece turbia o contaminada.

 

Solución de desnaturalización

Añada 49 ml de formamida, 7 ml de 20X SSC (pH 5,3) y 14 ml de H2O purificada a una cubeta de vidrio tipo Coplin y mezcle bien. Compruebe que el pH sea de 7,0-7,5 midiendo el pH a temperatura ambiente. Entre usos, conserve la solución tapada a 4 °C. Deséchela después de 7 días.

 

Soluciones de lavado de etanol (70 %, 85 % y 100 %)

Diluya etanol v/v al 100 % con H2O purificada para preparar las soluciones de lavado. Entre usos, conserve las soluciones tapadas a temperatura ambiente. Deseche las soluciones madre después de 6 meses.

 

Solución de lavado 0,4X SSC/0,3 % NP-40

Mezcle bien 20 ml de 20X SSC con 950 ml de H2O purificada. Añada 3 ml de NP-40. Mezcle bien hasta que el NP-40 se disuelva. Ajuste el pH a 7,0-7,5 con NaOH. Añada H2O purificada hasta un volumen final de 1 litro. Conserve la solución a temperatura ambiente. Deseche la solución madre después de 6 meses o si parece turbia o contaminada.

 

Solución de lavado 2X SSC/0,1 % NP-40

Añada 1 ml de NP-40. Ajuste el pH a 7,0-7,5 con NaOH. Añada H2O purificada hasta un volumen final de 1 litro. Conserve la solución a temperatura ambiente. Deseche la solución madre después de 6 meses o si parece turbia o contaminada.

 

ADN del ensayo

Realice el marcaje directo del ADN del ensayo (y del control sin marcar) con SpectrumGreenTM dUTP. Consulte el procedimiento en el kit Vysis CGH Nick Translation.

 
 
 
 
procedimientos de cgh

Controles 

Los controles positivos y negativos proporcionan comparaciones para evaluar la hibridación e interpretación de los datos de CGH. Como control negativo, utilice ADN normal tanto para el ADN del ensayo como para el ADN de referencia (n.º de cat. 32-804024, 32-802024). Los perfiles de intensidad de este experimento deben estar dentro de los valores umbral determinados por el análisis de imágenes. Como control positivo, utilice el ADN del ensayo (n.º de cat. 32-800227) que se extrae de una línea celular con aberraciones genéticas conocidas que son fáciles de detectar por medio de un análisis de CGH.

 

Portaobjetos con dianas de CGH en metafase normal

No realice un pretratamiento de los portaobjetos. Los portaobjetos se preparan utilizando métodos convencionales de preparación de portaobjetos citogenéticos optimizados para CGH. Los portaobjetos se preparan a partir de linfocitos estimulados con fitohemaglutinina (PHA) cultivados durante 48 a 72 horas antes de añadir timidina para sincronizar las células. La longitud del cromosoma es de 400-550 bandas. Los linfocitos proceden de un donante masculino con cariotipo normal.

 

Preparación de la mezcla de la sonda

Para lograr una hibridación con intensidades de señal equivalentes para el ADN marcado con SpectrumGreenTM y SpectrumRedTM, se aumenta la cantidad de ADN marcado con SpectrumGreen.

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml mezcle:
    10 µl (200 ng) de ADN del ensayo SpectrumGreen (marcado mediante nick translation), 1 µl (100 ng) de ADN de referencia genómica total SpectrumRed (n.º de cat. 32-804023 o 32-804024), 10 µl (10 µg) de ADN COT-1-1 humano (n.º de cat. 32-800028)
  2. Añada 1 µl (0,1 volúmenes) de acetato de sodio 3 M y, a continuación, añada 52,5 µl (2,5 volúmenes) de EtOH al 100 % para precipitar el ADN. Agite brevemente en un vórtex y colóquelo en hielo seco durante 15 minutos.
  3. Centrifugue a 12 000 rpm durante 30 minutos a 4°C para que el ADN forme un pellet. 
  4. Retire el sobrenadante y seque el pellet durante 10-15 minutos al vacío a temperatura ambiente.
  5. Resuspenda el pellet en 3 µl de H2O purificada y 7 µl de tampón de hibridación CGH. Desnaturalice la sonda calentando la mezcla durante 5 minutos en un baño de agua a 73 °C. NOTA: Desnaturalice la sonda mientras se deshidrata el portaobjetos (paso 3 de hibridación de la sonda con la metafase diana).

Hibridación de la sonda con la metafase diana 

  1. Marque las áreas de hibridación en el portaobjetos con un punzón con punta de diamante.
  2. Asegúrese de que la temperatura de la solución de desnaturalización es de 73 ± 1 °C. Sumerja el portaobjetos que contiene los frotis de metafases normales en la solución durante 5 minutos.
  3. Deshidrate el portaobjetos durante 1 minuto en una solución de etanol al 70 %, seguido de 1 minuto en solución de etanol al 85 % y 1 minuto en solución de etanol al 100 %.
  4. Seque el portaobjetos poniendo en contacto el borde inferior con un papel secante y limpiando la parte inferior con una toallita de papel.
  5. Coloque el portaobjetos sobre un calentador de portaobjetos a 45-50 °C para permitir que el EtOH restante se evapore.
  6. Aplique 10 µl de la mezcla de la sonda desnaturalizada en el portaobjetos. 
  7. Coloque inmediatamente el cubreobjetos y selle con adhesivo de caucho diluido.
  8. Coloque el portaobjetos en una cámara húmeda sellada e introdúzcala en un incubador a 37 °C durante 48-72 horas para la hibridación.

Lavado del portaobjetos 

  1. Coloque el recipiente de lavado con la solución de lavado 0,4X SSC/0,3 % NP-40 en un baño de agua a 74 ± 1 °C durante al menos 30 minutos antes de usarlo. Deséchelo después de 1 día de uso. Prepare un segundo recipiente de lavado con 2X SSC/0,1 % NP-40 a temperatura ambiente.
  2. Retire el sello adhesivo de caucho y el cubreobjetos y coloque inmediatamente el portaobjetos en la solución de lavado 0,4X SSC/0,3 % NP-40 a 74 ± 1 °C. Agite el portaobjetos durante 1-3 segundos.
  3. Repita el paso 2 con cada portaobjetos (no lave más de cuatro portaobjetos a la vez) y luego deje los portaobjetos en la solución durante 2 minutos.
  4. Coloque el portaobjetos en la solución de lavado 2X SSC/0,1 % NP-40 a temperatura ambiente. Agite el portaobjetos de 1 a 3 segundos y déjelo en la solución entre 5 segundos y 1 minuto.
  5.  Deje los portaobjetos secar en oscuridad.

Visualización de la hibridación

Aplique 10 µl de tinción de contraste DAPI II y coloque un cubreobjetos en cada lugar de hibridación.

 

 
 
 
 

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