Sondas de enumeración cromosómica (CEP): Información clave del producto

1. Preparación de la sonda

• Mezcle a temperatura ambiente 7 µl de tampón de hibridación CEP, 1 µl de sonda de ADN CEP y 2 µl de H2O purificada*.
• Centrifugue la mezcla durante 1-3 segundos, agítela en un vórtex y, a continuación, vuelva a centrifugarla.
• Caliente la mezcla durante 5 minutos en un baño de agua a 73 °C y, a continuación, colóquela sobre un calentador de portaobjetos a 45-50 °C.

*Para la hibridación simultánea de dos sondas CEP, sustituir 7 µl de tampón de hibridación de CEP, 1 µl de H2O purificada y 1 µl de cada una de las dos sondas de ADN CEP diferentes.

2. Preparación del portaobjetos

• Marque las zonas de hibridación con un punzón con punta de diamante. 
• Sumerja el portaobjetos en el baño desnaturalizante a 73 +/- 1 °C (formamida al 70 %/2X SSC) durante 5 minutos.
• Deshidrate el portaobjetos durante 1 minuto en EtOH al 70 %, 1 minuto en EtOH al 85 % y 1 minuto en EtOH al 100 %.
• Seque el portaobjetos y colóquelo sobre un calentador de portaobjetos (45-50 °C) durante un máximo de 2 minutos.

3. Hibridación

• Aplique 10 µl de la mezcla que contiene la sonda al portaobjetos. Coloque el cubreobjetos inmediatamente después de aplicar la sonda sobre el portaobjetos. (El portaobjetos no requiere sellado durante hibridaciones de corta duración).
• Coloque el portaobjetos en una cámara húmeda calentada previamente y deje hibridar durante al menos 30 minutos (pero no más de 60 minutos) en un incubador a 42 °C.
• Prepare un recipiente de lavado con 0,4X SSC/0,3 % NP-40 e introdúzcalo en el baño de agua a 73 +/- 1 °C durante al menos 30 minutos. Deseche la solución después de 1 día de uso. Prepare un segundo recipiente con 2X SSC/0,1 % NP-40 a temperatura ambiente.
• Retire el cubreobjetos y colóquelo inmediatamente en el recipiente de lavado con 0,4X SSC/0,3 % NP-40, agitando el portaobjetos durante 1-3 segundos. Repita el proceso para los otros tres portaobjetos y, a continuación, deje los cuatro portaobjetos en la cubeta tipo Coplin durante 2 minutos.
• Lave el portaobjetos en 2X SSC/0,1 % NP-40 a temperatura ambiente entre 5 segundos y 1 minuto, agitando durante 1-3 segundos al colocar el portaobjetos en el baño.
• Deje el portaobjetos secar al aire en oscuridad.

4. Interpretación

• Aplique 10 µl de tinción de contraste DAPI II al área diana del portaobjetos y coloque el cubreobjetos.
• Examine el portaobjetos con un juego de filtros adecuado.

5. Conservación 

• Conserve el portaobjetos a -20 °C en oscuridad. 

Los fluoróforos se decoloran fácilmente por exposición a la luz. Para limitar esta degradación, manipule todas las soluciones que contengan fluoróforos en ambientes con poca luz, incluidos los pasos que impliquen la manipulación del portaobjetos hibridado. Realice todos los pasos que no necesiten luz durante la manipulación (periodos de incubación, lavados, etc.) en oscuridad. 

Es muy recomendable el uso de un termómetro calibrado para la medición de la temperatura de las soluciones. 

Antes de abrir por primera vez cada vial de reactivo, centrifugue durante 2-3 segundos con una microcentrífuga estándar de sobremesa. 

Coloque una cubeta tipo Coplin con solución desnaturalizante a temperatura ambiente en un baño de agua a 73 +/- 1 °C durante aproximadamente 30 minutos antes de su uso. 

Si se han hibridado más de cuatro portaobjetos, estos se deben lavar en más de un lote. La temperatura de la solución de lavado debe volver a 73 +/- 1 °C antes del lavado de cada lote.

20X SSC (para 500 ml de 20X SSC, pH 5,3) 

Añada 132 g de 20X SSC a 400 ml de H2O y mézclelo bien. Ajuste el pH a temperatura ambiente con un medidor de pH a 5,3 utilizando HCl concentrado y ajuste el volumen final de 500 ml. Filtre la solución a través de una unidad de filtración con un poro de 0,45 micras. Conserve la solución durante un máximo de seis meses a temperatura ambiente.

2X SSC/0,1 % NP-40 (para 1 litro)

Añada 100 ml de 20X SSC (pH 5,3) a 850 ml de H2O purificada. Añada 1,0 ml de NP-40. Ajuste el pH a 7,0-7,5 con NaOH con un medidor de pH. Añada H2O hasta un volumen final de la solución de 1 litro. Conserve la solución durante un máximo de seis meses a temperatura ambiente.  

Solución de lavado 0,4X SSC/0,3 % NP-40 

Añada H2O hasta un volumen final de la solución de 1 litro. Filtre la solución a través de una unidad de filtración con un poro de 0,45 µm. Conserve la solución durante un máximo de seis meses a temperatura ambiente. Nota: La solución de lavado debe estar a 73 +/- 1 °C antes de su uso. A fin de mantener el intervalo de temperatura adecuado, DEBE colocar al mismo tiempo cuatro portaobjetos en la solución calentada. Si se han hibridado menos de cuatro portaobjetos, se deben utilizar portaobjetos de microscopio a temperatura ambiente para alcanzar la cifra de cuatro portaobjetos. Si se han hibridado más de cuatro portaobjetos, estos se deben lavar en más de un lote. La temperatura de la solución de lavado debe volver a 73 +/- 1 °C antes del lavado de cada lote. No retire los cubreobjetos de varios portaobjetos antes de colocar los portaobjetos en el baño de agua. Comience a cronometrar la incubación cuando añada el último portaobjetos al baño de agua.

Solución de desnaturalización (70 ml) 

Añada 49 ml de formamida, 7 ml de 20X SSC (pH 5,3) y 14 ml de H2O purificada a una cubeta de vidrio tipo Coplin y mezcle bien. Mida el pH a temperatura ambiente con un medidor de pH para comprobar que el pH está entre 7,0-8,0. Utilice cada lote de desnaturalizante durante siete días y después deséchelo. Entre periodos de uso, consérvelo a 4 °C.

Soluciones de lavado de etanol 

Para concentraciones finales del 70 %, 85 % y 100 %. Prepare diluciones v/v de etanol al 100 % con H2O. Utilice la dilución durante siete días como máximo y, a continuación, deséchela. Si la solución se evapora o se diluye, sustitúyala por una solución recién preparada. Entre periodos de uso, consérvela a temperatura ambiente.