Häufig gestellte Fragen (FAQs)

Anwendungen

 

Kann ich dieselbe Hybridisierungszone mehrmals einer FISH unterziehen?

Ja. Informationen zu sequenziellen FISH-Tests finden Sie im entsprechenden Abschnitt im Wissensportal.

 

Was ist die kleinste DNA-Größe (zusammenhängende DNA-Sequenz), die mithilfe der direkt markierten Vysis Sonden (CEP oder LSI) sichtbar gemacht werden kann?

Die Größe hängt von zahlreichen Faktoren ab. Im Allgemeinen liegt die untere Grenze bei ca. 30 Kilobasen.

 

Wie sind 2 Sonden zu mischen?

µl Hybridisierungspuffer, 1 &mgr;l gereinigtes Wasser und 1 &mgr;l JEDER Sonde für ein Gesamtvolumen von 10 &mgr;l hinzugeben.

 
 
 
 
Filter

 

Welche Filter werden für PathVysion, UroVysion und AneuVysion empfohlen?

  • PathVysion: (3 Filter) Grün/Orange v.2, DAPI/9-Orange und grüner Einzelpassfilter 
  • UroVysion: (4 Filter) DAPI, Rot/Grün, Gold und Aqua 
  • AneuVysion: (4 Filter) DAPI/Orange/Grün, grüner Einzelpassfilter, oranger Einzelpassfilter und Aqua-Einzelpassfilter 

Für weitere Informationen zu Filtern für andere Produkte wenden Sie sich bitte an den Vysis Technical Service unter +1-800-553-7042 x2.

 

Welche Art von Lichtquelle ist für die Fluoreszenzbeobachtung optimal?

Empfohlen wird eine 100-Watt-Quecksilberdampflampe, die alle 200 Stunden ausgetauscht werden sollte.

 

Warum sind meine Fluoreszenzsignale schwach?

Neben dem entsprechenden Filter wirken sich auch die Mikroskop-Anregungsquelle und das Alter der Lampe darauf aus, wie stark das Fluorophorsignal ausfällt. Wir empfehlen eine 100-Watt-Quecksilberdampflampe mit einer Verwendungsdauer von unter 200 Stunden. Einige Sondensignale sind heller oder weisen im Vergleich zu anderen Sondensignalen eine andere Form auf. Zum Beispiel ist ein LSI® Signal kompakter als ein CEP® Signal, sodass der Betrachter es unter Umständen als dunkler bewertet. Dabei ist das LSI Signal lediglich kleiner. Verschiedene WCP® Chromosomfarbstoffe weisen eine unterschiedliche Färbungsintensität auf, weshalb ein Betrachter einen bestimmten WCP® Chromosomfarbstoff unter Umständen dunkler wahrnimmt als den vorherigen.

 

Kann ein Texas Red Filter zur Betrachtung von Vysis SpectrumOrange Sonden verwendet werden?

Nein. Die SpectrumOrange Sonden erfordern die Verwendung eines Vysis SpectrumOrange Filters. Die Wellenlängen von Rot und Orange liegen im Spektrum nahe genug beieinander, um die Signale sehen zu können, die Signalintensität ist jedoch nicht reproduzierbar.

 

Kann ein Gold Filter zur Betrachtung von Vysis SpectrumOrange Sonden verwendet werden?

Nein. Die SpectrumOrange Sonden erfordern die Verwendung eines Vysis SpectrumOrange Filters. Die Wellenlängen von Gold und Orange liegen im Spektrum nahe genug beieinander, um die Signale sehen zu können, die Signalintensität ist jedoch nicht reproduzierbar.

 
 
 
 
Allgemeine Hinweise

 

Was ist der Unterschied zwischen „FDA-Freigabe“ und „FDA-Zulassung“?

„FDA-Zulassung“ bezieht sich auf Produkte, die im Rahmen des PMA-Prozesses (Pre-Market Approval) für neue Produkte eine Marktzulassung erhalten. „FDA-Freigabe“ bezieht sich auf Produkte, die nach einer 510(k)-Prüfung eine Marktfreigabe erhalten. Der PMA-Prozess ist im Allgemeinen strenger und gilt für wirklich neue Produkte. Bei Produkten, die konzeptionell bereits auf dem Markt erhältlichen Produkten ähneln oder bei denen es sich um Weiterentwicklungen bestehender Produkte handelt, kann wahlweise eine FDA-Freigabe gemäß Abschnitt 510(k) des US-amerikanischen Gesetzes über Nahrungsmittel, Arzneimittel und Kosmetika beantragt werden.

 

Kann Vysis Empfehlungen zur Notation von Patientenergebnissen aussprechen?

Nein. Vysis ist kein klinisches Labor und kann keine Empfehlungen zur Notation von Patientenergebnissen aussprechen. Dies gilt ebenso für die Nomenklatur.

 

Was ist der Unterschied zwischen ASRs und IVDs?

ASR – Analyt-spezifisches Reagenz. ASRs sind Produkte zur Verwendung in hauseigenen Testverfahren, die laut Hersteller die Anforderungen der guten Herstellungspraxis (GMP) erfüllen. ASRs müssen gemäß 21 CFR § 809.10(e) der US-amerikanischen Verwaltungsverordnungen gekennzeichnet werden. Werbematerialien unterliegen 21 CFR § 809.30(d). Das Labor, das einen hauseigenen Test mithilfe der ASRs entwickelt, muss die anfordernde Person über das Testergebnis informieren und hierzu dem Befund die folgende Erklärung gemäß 21 CFR § 809.30(e) beifügen: „Die Entwicklung dieses Tests und die Bestimmung seiner Leistungsmerkmale wurden durch (Laborname) durchgeführt. Er wurde von der US-amerikanischen FDA weder freigegeben noch zugelassen.“ ASRs haben keine Ansprüche hinsichtlich Ihres vorgesehenen Verwendungszwecks; das jeweilige Labor ist dafür verantwortlich, einen vorgesehenen Verwendungszweck und Einschränkungen festzulegen. Beispiele von ASR-Produkten von Vysis: LSI® bcr/abl, LSI DiGeorge, TotelVysionIVD – In-vitro-Diagnostikum. Ein diagnostisches Produkt, das von der FDA für einen oder mehrere spezifische Verwendungszwecke freigegeben oder zugelassen ist und das festgelegte analytische und klinische Leistungsmerkmale aufweist. Beispiele von IVD-Produkten von Vysis: PathVysion, UroVysion, AneuVysion, CEP® 8 SO, CEP 12 SO, CEP X/Y.

 

Warum unterscheiden sich die Chargennummern auf den Fläschchen von den Chargennummern auf den Kits?

Die Chargennummer auf dem Analysenzertifikat jeder Sonde ist die Chargennummer des Kits. Die meisten Kits bestehen aus einem Fläschchen mit Sonde und einem Fläschchen mit Hybridisierungspuffer. Weitere Kits enthalten Sonden, die bereits mit dem Hybridisierungspuffer gemischt wurden. Jede Komponente verfügt über eine einmalige Teile- und Chargennummer, die sich von der des Kits unterscheidet. Wenn Sie das Produkt aus unserem Katalog bestellen, handelt es sich bei der anzugebenden Nummer um die Katalognummer und nicht um die einzelnen Teilenummern, die sich auf den Kit-Fläschchen befinden.

 
 
 
 
Sonden

 

Wie stabil sind die Sonden? Kann ich sie einfrieren und wieder auftauen? Kann ich sie verdünnt lagern? 

Bei ordnungsgemäßer Lagerung sind die Sonden stabil. Sie können mehrmals eingefroren und wieder aufgetaut werden. Das Risiko eines Sondenabbaus ist geringer, wenn die Sonden unverdünnt gelagert werden.

 

Muss ich das Signal amplifizieren?

Nein, eine Signalamplifikation ist nicht erforderlich. Die direkt markierten Vysis Sonden erzeugen bereits ohne zusätzliche Detektionsschritte ein helles Signal.

 

Kann ich die pro Assay verwendete Sondenmenge verringern?

Nein, die Signalstärke ist dann zu schwach.

 

Was ist der Unterschied zwischen direkt und indirekt markierten Sonden?

Bei direkt markierten Sonden ist das Fluorophor kovalent an die DNA-Sonde gebunden. Indirekt markierte Sonden enthalten ein Hapten, wie z. B. Biotin oder Digoxigenin. Durch mehrere Posthybridisierungsschritte („Sandwich-Hybridisierung“) kann eine Bindung des Fluorophors an das Hapten erreicht werden.

 

Wann verwende ich WCP Sonden und wann CEP Sonden?

CEP Sonden werden sowohl bei Interphase-Zellen als auch bei Metaphasen-Spreitungen verwendet und können zur Bestimmung einer Ploidie (z. B. Trisomie 18) eingesetzt werden. WCP Sonden zur Einfärbung eines einzelnen Chromosoms werden ausschließlich bei Metaphasen-Spreitungen eingesetzt. Die Verwendung auf Interphase-Zellen wird von der wissenschaftlichen Gemeinschaft nicht empfohlen, da bei der Auswertung der Ergebnisse Schwierigkeiten auftreten können.

 

Kreuzreagieren die WCP Sonden mit anderen humanen Chromosomen oder mit Nagetierchromosomen?

Die WCP Sonden können mit anderen humanen Chromosomen in gewissem Maße kreuzreagieren. Die Sondenmischung enthält humane Cot-1®* DNA, um die Bindung an wiederholte Sequenzen der Ziel- und der Nichtziel-DNA zu reduzieren. Sie können weitere humane Cot-1 DNA hinzugeben. Einige der WCP Sonden werden aus Genbanken flusssortierter humaner Chromosomen gewonnen, die aus somatischen Zellhybriden von Mensch oder Hamster stammen. Im Falle einer Untersuchung somatischer Zellhybriden auf deren Gehalt an humanen Chromosomen können Sie GIBCO/BRL Cot-1 DNA vom Hamster oder Cot-1 DNA von der Maus als Blockierungsreagenz verwenden.

 

Welcher Hybridisierungspuffer ist bei der Vermischung von LSI und CEP Sonden zu verwenden?

Verwenden Sie den LSI Hybridisierungspuffer. Der CEP Puffer ist stringenter, der LSI Puffer weniger stringent. LSI Sonden benötigen den weniger stringenten Puffer, um am Ziel hybridisieren zu können. Nicht alle Konfigurationen von LSI-CEP-Kombinationen wurden mit Vysis getestet. Bei einigen Sondenmischungen ist es möglich, dass die CEP Sonde aufgrund der weniger stringenten Bedingungen mit anderen Chromosomen kreuzhybridisiert.

 

Wie sind 2 Sonden zu mischen?

µl Hybridisierungspuffer, 1 &mgr;l gereinigtes Wasser und 1 &mgr;l JEDER Sonde für ein Gesamtvolumen von 10 &mgr;l hinzugeben.

 

Warum sind meine Fluoreszenzsignale schwach?

Neben dem entsprechenden Filter wirken sich auch die Mikroskop-Anregungsquelle und das Alter der Lampe darauf aus, wie stark das Fluorophorsignal ausfällt. Wir empfehlen eine 100-Watt-Quecksilberdampflampe mit einer Verwendungsdauer von unter 200 Stunden. Einige Sondensignale sind heller oder weisen im Vergleich zu anderen Sondensignalen eine andere Form auf. Zum Beispiel ist ein LSI Signal kompakter als ein CEP Signal, sodass der Betrachter es unter Umständen als dunkler bewertet. Dabei ist das LSI Signal lediglich kleiner. Verschiedene WCP Chromosomfarbstoffe weisen eine unterschiedliche Färbungsintensität auf, weshalb ein Betrachter einen bestimmten WCP Chromosomfarbstoff unter Umständen dunkler wahrnimmt als den vorherigen. Im Vergleich zu einigen amplifizierten Signalen indirekt markierter Sonden wird das Signal direkt markierter Sonden von einigen Betrachtern unter Umständen als schwach beschrieben. Die Signale der Vysis Sonden können kleiner erscheinen, die Helligkeit ist jedoch die gleiche. Das Signal lässt sich auch aufgrund der fehlenden Hintergrundfluoreszenz besser erkennen und als echtes Signal ausmachen.

 
 
 
 
Probenvorbereitung

 

Wie sollten meine (in der Metaphase vorbereiteten) Objektträger vor dem FISH-Test aussehen?

Bewerten Sie ihre vorbereiteten Objektträger unter einem Phasenkontrastmikroskop.

  • Ausreichende Vorbereitung: Die Chromosomen und Zellkerne erscheinen dunkelgrau, sind nicht refraktil und weisen nur wenig Zytoplasma auf.
  • Ungenügende Vorbereitung: Die Zellen sind „phasenhell“ und erscheinen weiß mit einem Halo um den Zellkern. Mögliche Ursache: Die Probe auf dem Objektträger ist während der Vorbereitung möglicherweise zu schnell ausgetrocknet. Lösung:
    • Um die den Objektträger umgebende Feuchtigkeit beim „Aufträufeln“ der Probe zu erhöhen, den Objektträger auf einem Gestell für 20 Minuten über ein 65 °C warmes Wasserbad stellen.
    • Den Objektträger nicht backen; gebackene Objektträger können sich negativ auf die Hybridisierungsergebnisse auswirken.
    • Den Objektträger bei Raumtemperatur über Nacht trocknen lassen. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn der Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur ruhen kann.
  • Es ist zwar nicht optimal, wenn Objektträger an demselben Tag vorbereitet und verwendet werden, mit den folgenden Schritten lassen sich Objektträgern jedoch auch an einem einzigen Tag vorbereiten: Den Objektträger zuerst auf einem 45 °C warmen Objektträgerwärmer 30 Minuten trocknen lassen, dann den Objektträger in einer 70 %igen, einer 85 %igen sowie einer 100 %igen Ethanollösung jeweils eine Minute dehydrieren und erst dann die Ziel-DNA denaturieren (Schritt 1 beim FISH-Verfahren).

 

Nach der FISH erhalte ich ein undeutliches Signal und der Objektträger ist von einem „Schleier“ bedeckt. Wie kann ich dies korrigieren?

Normalerweise besteht die Ursache darin, dass zu viele Zellen auf den Objektträger gegeben wurden. Der Schleier stammt vom Zellzytoplasma. Versuchen Sie, das Zellpellet mit frischem Fixiermittel zu spülen, verdünnen Sie die Probe und geben Sie sie auf einen neuen Objektträger. Einige Probenarten (Abstriche, Knochenmark- oder Blutausstriche, in Paraffin eingebettete Proben) sind möglicherweise anfälliger für das „Schleier“-Phänomen. Diese Probenarten erfordern möglicherweise zusätzliche Behandlungen:

  • Ausstrich: In 70 %iger Essigsäure 30 Sekunden spülen, an der Luft trocknen lassen, dann in 100 %-igem Methanol 30 Sekunden spülen.
  • Paraffineinbettung: Zeit für Proteinverdau verlängern.

 

Warum ist die Gegenfärbung zu schwach?

Die Objektträger wurden vor der Gegenfärbung möglicherweise nicht ordnungsgemäß getrocknet. Achten Sie darauf, die Objektträger nach dem Auftragen der Zellen 24 Stunden ruhen zu lassen. Versuchen Sie, die Proben durch mehrere Ethanolspülgänge zu dehydrieren und führen Sie die Gegenfärbung anschließend erneut durch. Achten Sie auch darauf, zur Betrachtung der Gegenfärbung den korrekten Filter zu verwenden. Von Vysis gibt es zwei Konzentrationen an DAPI-Gegenfärbung. DAPI II (125 ng/ml) ist für die Verwendung mit CEP® und LSI® Sonden vorgesehen und ist eine achtfache Verdünnung von DAPI I (1000 ng/ml), welches zur Verwendung mit WCP® Chromosomfarbstoffen vorgesehen ist. Die Verwendung von DAPI II mit WCP Sonden kann eine zu schwache Gegenfärbung zur Folge haben.

 

Warum ist die Zellmorphologie meiner Proben verzerrt?

Verschiedene Gewebe- oder Probenarten benötigen ggf. unterschiedliche Denaturierungszeiten. Wenn die Denaturierungszeit für die Probenart zu lang ist, erscheinen die Zellen verzerrt. Beginnen Sie mit einer Denaturierungszeit von vier Minuten und nehmen Sie anschließend ggf. Anpassungen vor.

 

Wie lange kann ich meine vorbereiteten Objektträger lagern, damit anschließend noch eine effektive Hybridisierung möglich ist?

Wenn die Objektträger stickstoffgekühlt bei –20 °C gelagert werden, sollten sie mindestens sechs Monate verwendbar sein.

 

Wie lange kann ich meine Objektträger nach der Hybridisierung lagern, damit anschließend noch Fluoreszenz sichtbar ist?

Wenn die Objektträger bei –20 °C gelagert und nicht allzu häufig dem hochintensiven UV-Licht der Quecksilberdampflampe ausgesetzt werden, halten sie mehrere Monate. Die Signale werden im Laufe der Zeit und bei Lichtexposition schwächer.

 

Kann ich eine FISH auch dann noch ausführen, wenn ich an meinen Metaphase-Spreitungen eine G-Bänderung durchgeführt habe?

Ja, ein mögliches Verfahren wird in der folgenden Arbeit beschrieben:

 

JalalSM, Law ME, Christensen ER, Spurbeck JL, Dewald GW. Method forsequential staining of GTLbanded metaphases with fluorescentlabeledchromosome specific paint probes. Am J Med Genet 46:98103, 1993.

 
 
 
 
Reagenzien

 

Warum erfordert der FISH-Assay bei den Vysis Verfahren keine Zugabe von Eindeckmittel?

Alle Vysis Gegenfärbungen (DAPI-I-Gegenfärbung, DAPI-II-Gegenfärbung, Propidiumiodid-Gegenfärbung), enthalten bereits ein Eindeckmittel in der Lösung.

 

Die Spüllösung mit 0,1 % NP-40 trübt sich, wenn ich sie erwärme. Was stimmt nicht?

Alles ist in Ordnung. Das getrübte Erscheinungsbild ist normal und beeinträchtigt nicht den Spülvorgang.

 

Was ist der Unterschied zwischen DAPI I und DAPI II?

Die Konzentration von DAPI I beträgt 1000 ng/ml, was dem Achtfachen der DAPI-II-Konzentration (125 ng/ml) entspricht. Das höher konzentrierte DAPI I funktioniert gut mit WCP® Chromosomfarbstoffen und führt zu einer hellen visuellen Gegenfärbung bei Metaphase-Chromosomen. Das weniger stark konzentrierte DAPI II ist für die Verwendung mit den CEP® und LSI® Sonden vorgesehen, deren kompaktere Signale von zu viel DAPI-Gegenfärbung der Zellkern-DNA überlagert werden können.

 

Was ist der Unterschied zwischen den Paraffin-Vorbehandlungskits I, II und III?

Das Paraffin-Vorbehandlungskit I sollte bei PathVysion® Her2/neu-Gewebeproben verwendet werden. Es wurde von der US-amerikanischen Lebens- und Arzneimittelbehörde FDA für diese Anwendung zugelassen. Die Vorbehandlung mit diesem Kit ist zeitaufwändiger (dauert ca. eine Stunde länger) als mit Kit II. Das Protokoll des Paraffin-Vorbehandlungskits II ist kürzer und das Kit dient der Verwendung bei paraffineingebetteten Schnitten, sofern es sich nicht um PathVysion HER2- und Prostatagewebe handelt. Das Paraffin-Vorbehandlungskit III weist ein stringenteres Protokoll auf, das bei Prostatagewebe oder zur Fehlerbehebung bei anspruchsvollen Proben Anwendung finden sollte. Dieses Kit enthält das Enzym Proteinase K anstelle von Pepsin.

 

Aus welchen Komponenten bestehen die Hybridisierungspuffer?

  • CEP Hybridisierungspuffer: 55 % Formamid, 1x SSC, 10 % Dextransulfat
  • LSI/WCP Hybridisierungspuffer: 50 % Formamid, 2x SSC, 10 % Dextransulfat
 
 
 
 

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