ToTelVysion TM: Multi-color FISH-DNA-Sondenmischungen

ToTelVysionTM: Multi-color FISH-DNA-Sondenmischungen

Probenvorbehandlung vor der Codenaturierung

 

Die folgende Vorbehandlungsmethode wird vor der Hybridisierung der ToTelVysion Sonden auf vorbereiteten Metaphase-Objektträgern dringend empfohlen. Der Zweck dieses Verfahrens ist es, die chromosomale DNA für die Hybridisierung zugänglich zu machen und die Morphologie der aus der Codenaturierung hervorgegangenen Chromosomen zu schützen.

  1. Die Objektträger mit den Proben in einem Coplin-Färbetrog mit 2x-SSC-Lösung bei 73 °C 2 Minuten inkubieren. 
  2. Die Objektträger in einem Coplin-Färbetrog mit Protease-/Pepsinlösung bei 37 °C 10 Minuten inkubieren. 
  3. Die Objektträger in einem Coplin-Färbetrog mit PBS bei Raumtemperatur 5 Minuten spülen. 
  4. Die Objektträger bei Raumtemperatur 5 Minuten in einen Coplin-Färbetrog mit Formaldehydlösung setzen. 
  5. Die Objektträger aus der Formaldehydlösung entnehmen und in einem Coplin-Färbetrog mit PBS bei Raumtemperatur 5 Minuten spülen. 
  6. Die Objektträger 1 Minute in 70 % Ethanol, dann 1 Minute in 85 % Ethanol und 1 Minute in 100 % Ethanol dehydrieren. 
  7. Die Objektträger an der Luft trocknen lassen.

 

Die mehrfarbige ToTelVysion DNA-FISH-Sondenmischung umfasst insgesamt 62 DNA-FISH-Sonden.

 

 
Komponente Mehrfarbige ToTelVysion DNA-Sonde
Menge 30 &mgr;l x 15 Fläschchen mit verschiedenen Sondenmischungen
Zusammensetzung Fluorophor-markierte TelVysion, CEP® und LSI® Sonden und mit Hybridisierungspuffer mit Dextransulfat, Formamid und SSC (pH-Wert 7,0) gemischte blockierende DNA
Lagerung Lichtgeschützt bei –20 °C 
 
 
TOTELVYSION FLÄSCHCHEN-NR. SONDENMISCHUNG – BESCHREIBUNG
Mischung 1 TelVysion 1p SpectrumGreen, TelVysion 1q SpectrumOrange, TelVysion Xp/Yp SpectrumOrange und SpectrumGreen, CEP X SpectrumAqua
Mischung 2 TelVysion 2p SpectrumGreen, TelVysion 2q SpectrumOrange, TelVysion Xq/Yq SpectrumOrange und SpectrumGreen, CEP X SpectrumAqua
Mischung 3

TelVysion 3p SpectrumGreen, TelVysion 3q SpectrumOrange, TelVysion 22q SpectrumOrange und SpectrumGreen, LSI bcr (22q11) SpectrumAqua

Mischung 4 TelVysion 4p SpectrumGreen, TelVysion 4q SpectrumOrange, TelVysion 21q SpectrumOrange und SpectrumGreen, LSI AML (21q22) SpectrumAqua
Mischung 5 TelVysion 5p SpectrumGreen, TelVysion 5q SpectrumOrange 
Mischung 6 TelVysion 6p SpectrumGreen, TelVysion 6q SpectrumOrange, TelVysion 13q SpectrumOrange und SpectrumGreen, LSI 13 (13q14) SpectrumAqua
Mischung 7 TelVysion 7p SpectrumGreen, TelVysion 7q SpectrumOrange, TelVysion 14q SpectrumOrange und SpectrumGreen, LSI TCR (14q11.2) SpectrumAqua
Mischung 8 TelVysion 8p SpectrumGreen, TelVysion 8q SpectrumOrange, TelVysion 17p SpectrumOrange und SpectrumGreen, CEP 17 SpectrumAqua
Mischung 9 TelVysion 9p SpectrumGreen, TelVysion 9q SpectrumOrange, TelVysion 17q SpectrumOrange und SpectrumGreen, CEP 17 SpectrumAqua
Mischung 10 TelVysion 10p SpectrumGreen, TelVysion 10q SpectrumOrange, TelVysion 15q SpectrumOrange und SpectrumGreen, LSI PML (15q22) SpectrumAqua
Mischung 11 TelVysion 11p SpectrumGreen, TelVysion 11q SpectrumOrange, TelVysion 18p SpectrumOrange und SpectrumGreen, CEP 18 SpectrumAqua
Mischung 12 TelVysion 12p SpectrumGreen, TelVysion 12q SpectrumOrange, TelVysion 18q SpectrumOrange und SpectrumGreen, CEP 18 SpectrumAqua
Mischung 13 TelVysion 16p SpectrumGreen, TelVysion 16q SpectrumOrange
Mischung 14 TelVysion 19p SpectrumGreen, TelVysion 19q SpectrumOrange, LSI 19p13 SpectrumAqua
Mischung 15 TelVysion 20p SpectrumGreen, TelVysion 20q SpectrumOrange 

 

 

Erforderliche Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind

  • 12 N HCl (zur Anpassung des pH-Werts der Spüllösungen) 
  • 1 N NaOH (zur Anpassung des pH-Werts der Spüllösungen) 
  • Coplin-Färbetröge
  • Kalibriertes Thermometer 
  • Pinzette 
  • Messzylinder (100 bis 1000 ml)
  • Magnetrührer 
  • 100 % Ethanol 
  • Mikrozentrifuge 
  • Mikroliter-Pipettenspitzen für Volumina von 1 bis 10 &mgr;l 
  • Mikroliter-Pipettiereinheit für Volumina von 1 bis 10 &mgr;l 
  • pH-Messgerät 
  • Vorgereinigte Mikroskopobjektträger aus Glas 
  • Gereinigtes Wasser (destilliert oder entionisiert) 
  • Schaltuhr 
  • Vortexmischer 
  • Wasserbad (37 °C bis 73 °C)
  • Fluoreszenzmikroskop 
  • Inkubator (37 °C) 
  • 20x Standard-Natriumcitrat (SSC), 500 g (Listen-Nr. 02J10-032); NP-40, 4000 &mgr;l (Listen-Nr. 07J05-001; Menge: 2)
  • Formamid, ultrarein 
  • DAPI II-Gegenfärbung 
  • Objektträgerwärmer (45 bis 50 °C) 
  • Immersionsöl für Fluoreszenzmikroskop 
  • Kautschukkleber 
  • Deckgläser (Durchmesser: 12 mm)
  • Marker mit Diamantspitze
  • Einwegspritze
  • pH-Indikatorstreifen
  • 0,45-&mgr;m-Filtereinheit
  • Befeuchteter Behälter
  • Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 
  • 10 %iges neutral gepuffertes Formalin 
  • 2 M Magnesiumchlorid (MgCl2) 
  • Protease/Pepsin

 

Vorbereitung des Probenziels

Um alle 15 ToTelVysion Mischungen zu hybridisieren, mindestens 3 Objektträger mit Proben mit jeweils 5 markierten Zielbereichen pro Objektträger (insgesamt 15 Zielbereiche) verwenden.

 

totelvysion-multi-color-dna-fish-probe-mixtures-slide.gif

Beispiel für Objektträger Nr. 1 mit den Zielen 1, 2, 3, 4 und 5 Diese Zielanordnungsschritte (jeweils 5 Ziele pro Objektträger) bei den Objektträgern 2 und 3 wiederholen.

 

 
 
 
 
Vorbereitung der Probe

Vorbereiten der Sonde und Auftragen der Sondenmischung auf den Objektträger mit der Probe

  1. Jede ToTelVysion Sondenmischung wird vorgemischt und in einem Hybridisierungspuffer vorbereitet. Die Fläschchen aus dem –20 °C (± 5 °C) kühlen Lagerort entnehmen. Bei Raumtemperatur auftauen lassen. 
  2. Jedes der aufgetauten Fläschchen mit Sondenmischung in einer Mikrozentrifuge 1 bis 3 Sekunden zentrifugieren. 
  3. Im Vortex mischen und noch einmal kurz zentrifugieren. 
  4. Mithilfe einer Mikroliter-Pipettiereinheit aus dem Fläschchen 3 &mgr;l Sonde entnehmen und in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben. Alle Sonden der 15 Fläschchen auf die gleiche Weise vorbereiten. 
  5. Um die Sonde zu denaturieren, jedes der Mikrozentrifugenröhrchen, das 3 &mgr;l Sonde enthält, für 5 Minuten in ein 73 ± 1 °C warmes Wasserbad setzen. 
  6. Die Röhrchen aus dem Wasserbad entnehmen. 
  7. Damit die Sonde an die Ziel-DNA binden kann, die Röhrchen auf einen 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer stellen.

Hinweis: Wenn die Objektträger bereit sind, sobald die Sonde denaturiert ist, kann die Sonde umgehend auf die Ziel-DNA aufgetragen werden. 

 

Hybridisierung der Sonde mit dem Probenziel

Hinweis: Einen befeuchteten Behälter vorbereiten. Hierzu ein mit Wasser befeuchtetes Papiertuch an der Innenseite eines luftdichten Behälters platzieren. 

  1. Die Objektträger aus dem 100 %igen Ethanol entnehmen. 
  2. Die Objektträger abtrocknen. Hierzu die untere Kante der einzelnen Objektträger an ein Löschpapier halten und anschließend die Unterseite der einzelnen Objektträger mit einem Papiertuch abwischen. 
  3. Damit das Ethanol verdunsten kann, die Objektträger für 2 Minuten auf einen 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer stellen. 
  4. 3 µl Sondenmischung auf 1 Zielbereich geben und sofort ein rundes Deckglas mit 12 mm Durchmesser aufsetzen. Diese Schritte für die übrigen 14 Zielbereiche wiederholen.

Hinweis: Die Deckgläser der einzelnen Zielbereiche dürfen nicht miteinander in Kontakt kommen. Aufgrund des Kapillareffekts, der zwischen sich berührenden Deckgläsern auftritt, würde die Sonde von 1 Ziel auf das andere übertragen.

 

5. Jedes Deckglas mit Kautschukkleber versiegeln und dabei darauf achten, dass der Kautschukkleber die Kante des Deckglases überdeckt, sodass die Lücke zwischen Deckglas und Objektträgeroberfläche vollständig abgedichtet ist. 

 

6. Die Objektträger in den vorgewärmten befeuchteten Behälter setzen und den Behälter 12 bis 24 Stunden in einen 37 °C warmen Inkubator stellen. 

 

Spülen des Objektträgers

Die Spüllösungen vorbereiten:

Hinweis: Die Lösungen vor dem Spülgang die erforderliche Temperatur annehmen lassen.

  • 70 ml 0,4x SSC/0,3 % NP-40 in einen Coplin-Färbetrog füllen. Den Färbetrog mindestens 30 Minuten vor Gebrauch in ein 73 ± 1 °C warmes Wasserbad stellen. Die Lösung kann 1 Tag lang verwendet werden und ist anschließend zu entsorgen.
  • 70 ml 2x SSC/0,1 % NP-40 in einen Coplin-Färbetrog füllen. Bei Raumtemperatur verwenden. Die Lösung kann 1 Tag lang verwendet werden und ist anschließend zu entsorgen.

Hinweis: Zur Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen Temperatur in der Lösung aus 0,4x SSC/0,3 % NP-40 4 Objektträger gleichzeitig spülen. Um bei weniger als 4 Objektträgern dennoch eine Gesamtzahl von 4 Objektträgern zu erreichen, leere, raumwarme Objektträger hinzugeben.

 

 7.  Das Deckglas von einem Objektträger abnehmen und den Objektträger sofort in eine 73 ± 1 °C warme Lösung aus 0,4x SSC/0,3 % NP-40 setzen. Den Objektträger 1 bis 3 Sekunden auf- und abbewegen. Diesen Schritt bei allen übrigen Objektträgern wiederholen.  

 

8.   Die Objektträger nach 2 Minuten entnehmen.

 

9.  Die Objektträger in eine raumwarme Lösung aus 2x SSC/0,1 % NP-40 setzen. Die Objektträger 1 bis 3 Sekunden auf- und abbewegen. Die Objektträger nach 30 Sekunden bis 2 Minuten entnehmen. 

 

Visualisierung der Hybridisierung

  1. Die Objektträger an einem dunklen Ort an der Luft trocknen lassen.
  2. Auf die einzelnen Zielbereiche der Objektträger jeweils 3 &mgr;l DAPI-II-Gegenfärbung geben und ein rundes Deckglas mit einem Durchmesser von 12 mm aufsetzen. Alternativ auf jede Objektträgerhälfte jeweils 10 &mgr;l DAPI-II-Gegenfärbung geben und ein Deckglas mit den Abmessungen 22 x 50 mm auf die Gegenfärbung setzen. Zum Entfernen von überschüssigem DAPI auf die Oberseite des Deckglases leichten Druck ausüben. Mit einem Papiertuch etwaige Feuchtigkeit aufsaugen. 

Einstellen der ThermoBrite Parameter

Die einzelnen Objektträger (mit aufgetragener Sonde und aufgesetztem Deckglas) sofort auf die Platte des ThermoBrite stellen. Die Feuchtigkeitsstreifen mit Wasser befeuchten und in den Deckel legen.

  1. Jedes Deckglas mit Kautschukkleber versiegeln und dabei darauf achten, dass der Kautschukkleber die Kante des Deckglases überdeckt, sodass die Lücke zwischen Deckglas und Objektträgeroberfläche vollständig abgedichtet ist.
  2. Für kultivierte Lymphozyten und Amniozyten die Denaturierungstemperatur auf 70 °C und die Denaturierungszeit auf 3 Minuten einstellen. (Hinweis: Diese Temperaturen müssen möglicherweise je nach Probentyp angepasst werden. Weitere Informationen hierzu finden Sie im ThermoBrite Benutzerhandbuch (55-005322).)
  3. Die Hybridisierungstemperatur auf 37 °C und die Hybridisierungszeit auf über Nacht (12 bis 16 Stunden) einstellen.
  4. Wenn die Hybridisierungszeit abgelaufen ist, die Objektträger wie zuvor beschrieben unter Einhaltung des schnellen Spülverfahrens spülen.
  5. Objektträger im Dunkeln an der Luft trocknen lassen.
  6. Auf die einzelnen Zielbereiche des Objektträgers jeweils 3 &mgr;l DAPI-II-Gegenfärbung geben und ein rundes Deckglas mit einem Durchmesser von 12 mm aufsetzen.
 
 
 
 

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