Vorbehandlung von Paraffinproben

Wenn Objektträger mit Proben von Paraffinschnitten im Vorfeld vorbereitet und bei 56 °C gebacken wurden, fahren Sie mit den verbliebenen Schritten des Vorbehandlungsprotokolls fort und nehmen anschließend Hybridisierungen mit den HER2/neu-/CEP® 17-Sonden vor.

 

Entparaffinierung der Objektträger

Hemo-De ist ein nichttoxisches Lösungsmittel, dessen Eigenschaften denen von Xylol ähneln, und dient zum Auflösen von Paraffin. Mit Ethanol wird die Probe dehydriert und das verbliebene Paraffin gelöst, sodass die Probe für die Vorbehandlung bereit ist.

____ 1. Die Objektträger 10 Minuten in raumwarmes Hemo-De eintauchen.

____ 2. Diesen Schritt zweimal wiederholen und dabei jedes Mal neues Hemo-De verwenden.

____ 3. Die Objektträger 5 Minuten in raumwarmem 100 %igem EtOH dehydrieren.

____ 4. Schritt 3 wiederholen.

____ 5. Die Objektträger an der Luft trocknen lassen oder für 2 bis 5 Minuten auf einen 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer stellen.

 

Vorbehandlung der Objektträger

HCl unterstützt die Lösung grundlegender Zellkernproteine und sorgt so dafür, dass die Sonden die DNA besser erreichen können. HCl wird auch dazu verwendet, extrazelluläre Matrixproteine zu extrahieren, die den Zugang zu den Zellen für die Sonde beschränken und im Gewebe zur Autofluoreszenz führen. Der Vorbehandlungspuffer unterstützt die Denaturierung von Proteinen und die Entfernung von Querverbindungen zwischen den Proteinen. Dies ist wichtig, um einen ausreichenden Proteaseverdau zu erreichen.

____ 1. Die Objektträger 20 Minuten in 0,2 N HCl eintauchen.

____ 2. Die Objektträger 3 Minuten in gereinigtes Wasser eintauchen.

____ 3. Die Objektträger 3 Minuten in Spülpuffer eintauchen.

____ 4. Die Objektträger 30 Minuten in 80 °C warme Vorbehandlungslösung eintauchen.

____ 5. Die Objektträger 1 Minute in gereinigtes Wasser eintauchen.

____ 6. Die Objektträger 5 Minuten in Spülpuffer eintauchen. Den Vorgang unter Verwendung des zweiten Spülpufferbehälters wiederholen. 

 

Behandlung von Objektträgern mit Protease

Die Protease dient dem Verdau von Gewebeproteinen und ist unerlässlich, damit die Sonden an die Ziel-DNA gelangen können.

____ 1. Die Objektträger aus dem zweiten Spülpufferbehälter entnehmen und zum Aufsaugen von überschüssigem Puffer ein Papiertuch an die Kanten der Objektträger halten.

____ 2. Die Objektträger 10 Minuten in 37 °C warme Protease-Lösung eintauchen.

____ 3. Die Objektträger 5 Minuten in Spülpuffer eintauchen. Den Vorgang unter Verwendung des zweiten Spülpufferbehälters wiederholen.

____ 4. Die Objektträger auf einem 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer 2 bis 5 Minuten trocknen lassen.

 

Fixierung der Probe

Durch die Probenfixierung wird der bei der Denaturierung und der Hybridisierung entstehende Gewebeverlust auf ein Minimum reduziert.

____ 1. Die Objektträger 10 Minuten in raumwarmes, 10 %ig gepuffertes Formalin eintauchen.

____ 2. Die Objektträger 5 Minuten in Spülpuffer eintauchen. Den Vorgang unter Verwendung des zweiten Spülpufferbehälters wiederholen.

____ 3. Die Objektträger auf einem 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer 2 bis 5 Minuten trocknen lassen. Mit dem Vysis LSI® Sondenprotokoll fortfahren.

 

Denaturierung der Probe

____ 1. Die Objektträger für 6 Minuten in eine auf 72 ± 1 °C vorgewärmte Denaturierungslösung setzen (< 6/Behälter).

____ 2. Jeweils 1 Minute in 70 %igem, 85 %igem sowie 100 %igem EtOH dehydrieren.

____ 3. Auf einem 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer 2 bis 5 Minuten trocknen lassen.

 

Hybridisierung

____ 1. Die Sonde auf Raumtemperatur vorwärmen, im Vortex mischen und herunterzentrifugieren.

____ 2. Auf den Probenbereich des Objektträgers 10 ml Sondenmischung geben.

____ 3. Ein Deckglas (Abmessungen: 22 x 22 mm) aufsetzen und die Kanten mit Kautschukkleber versiegeln.

____ 4. Die Objektträger in den vorgewärmten befeuchteten Behälter mit luftdichtem Deckel stellen und bei 37 °C über Nacht (14 bis 18 Stunden) inkubieren.

 

Spülvorgang nach der Hybridisierung

____ 1. In jeden der beiden Coplin-Färbetröge Posthybridisierungsspülpuffer geben. Einen Trog im 72 ± 1 °C warmen Wasserbad vorwärmen und den zweiten Trog auf Raumtemperatur vorwärmen.

____ 2. Zum Entfernen des Kautschukklebers vom Objektträger mit einer Pinzette die Abdichtung vorsichtig nach oben abziehen.

____ 3. Die Objektträger in raumwarmen Posthybridisierungsspülpuffer eintauchen und das Deckglas abheben.

____ 4. Zum Entfernen überschüssiger Flüssigkeit diese an der Objektträgerkante aufsaugen und anschließend den Objektträger 2 Minuten in 72 ± 1 °C warmen Posthybridisierungsspülpuffer eintauchen (< 6 Objektträger/Behälter).

____ 5. Die Objektträger aus dem Spülpuffer entnehmen und in aufrechter Position an einem dunklen Ort an der Luft trocknen lassen.

 

Gegenfärbung und Lagerung der Objektträger

____ 1. Auf den Zielbereich des Objektträgers 10 ml DAPI-Gegenfärbung geben und ein Deckglas aufsetzen. Die Objektträger vor der Signalzählung an einem dunklen Ort lagern. Alternativ gemäß dem nächsten Lagerungsschritt vorgehen.

____ 2. Die hybridisierten Objektträger (mit aufgesetzten Deckgläsern) bei –20 °C an einem dunklen Ort lagern. Die Objektträger nach der Entnahme aus der –20-°C-Lagerung Raumtemperatur annehmen lassen und erst dann unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachten.

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