Vorbereitung von humanen Polkörperzellen

Dieses Verfahren wird nach Abschluss der Polkörperentfernung durchgeführt. Polkörper werden mittels Biopsie aus unbefruchteten sowie befruchteten Eizellen mechanisch entnommen.

Vorgehensweise

  1. Ein Fixiermittel (Methanol:Eisessig im Verhältnis 3:1) vorbereiten und bis zum Einsatz im Gefrierschrank lagern.
  2. Einen Coplin-Färbetrog mit Methanol vorbereiten.
  3. In den Boden einer Petrischale (Abmessungen 35 x 10 mm) einen kleinen Kreis einkerben. Der Kreis markiert den Zielbereich, in den die Polkörper zu geben sind, und erleichtert ein späteres Umsetzen.
  4. Auf den gefrorenen Bereich des Objektträgers/der Objektträger die Probenkennung und relevante Informationen schreiben. Den Objektträger zur Vorreinigung mit dem Fixiermittel und einem fusselfreien Tuch abwischen.
  5. Einen Hohlschliff-Objektträger mit gereinigtem Wasser füllen.
  6. Die Spitze einer 25-&mgr;l-Kapillarpipette mittels eines Mikrobrenners erhitzen und gleichzeitig an der erhitzten Pipettenspitze ziehen, um diese zu verlängern und eine Spitze mit einem Innendurchmesser von 50 &mgr;m zu schaffen. Darauf achten, dass die verlängerte Pipettenspitze nach dem Abbrechen eine glatte und keine scharfe Kante aufweist. Eine scharfkantige Spitze kann den Polkörper beschädigen. Für eine glatte Kante die Spitze ggf. erneut abbrechen. Überprüfen, ob die Pipettenöffnung die richtige Größe aufweist, und erst dann den Polkörper aufnehmen; wenn der Durchmesser zu groß ist, erhöht dies die Wahrscheinlichkeit eines Polkörperverlusts.
  7. Eine geringe Menge (ca. 2 bis 3 &mgr;l) Wasser in die Pipette saugen.
  8. Mit einem Stereomikroskop in der Petrischale den Polkörper lokalisieren.
  9. Den Polkörper vorsichtig in die Pipette saugen und über dem mit Wasser gefüllten Hohlschliff-Objektträger positionieren. Den Polkörper durch leichtes Blasen von der Pipette lösen, sodass er in den mittigen Kreis des Hohlschliff-Objektträgers fällt.
  10. Zur Entnahme des Polkörpers aus dem Wasser den Polkörper zusammen mit einer geringen Menge Wasser in die attenuierte Pipette saugen. Die Zelle zusammen mit einer geringen Menge Wasser auf einen Mikroskop-Objektträger geben. Mit einem Marker mit Karbidspitze auf der Oberseite des Objektträgers um den Wassertropfen einen Kreis zeichnen.
  11. Den Polkörper im Wassertropfen trocknen lassen und den Objektträger dabei unter dem Inversmikroskop fortwährend beobachten. Wenn der Polkörper trocken ist, eine geringe Menge Fixiermittel (ca. 2 bis 3 &mgr;l) in dieselbe attenuierte Pipette saugen und auf den Polkörper träufeln.

    Hinweis: Wenn die ersten Polkörper erst 6 Stunden nach der Probenentnahme fixiert werden, zum Entfernen des gesamten Zytoplasmas das Fixiermittel erst unmittelbar vor vor der vollständigen Trocknung aufträufeln.
  12. Wenn das Zytoplasma nicht eindeutig aufgelöst ist, vor dem vollständigen Trocknen der Zelle aus der attenuierten Pipette einen weiteren Tropfen Fixiermittel auf die Zelle geben. Diesen Vorgang wiederholen, bis sich das Zytoplasma, das die Zelle umgibt, aufgelöst hat und nur noch der Zellkern verbleibt (das Fixiermittel mindestens 5 Mal aufträufeln).

    Hinweis: Für eine optimale Sondenhybridisierung muss das Zytoplasma vollständig entfernt werden.
  13. Mit dem Marker auf der Oberseite des Objektträgers um das Chromatin zwei Kreise zeichnen. Ein Kreis muss dabei etwas größer sein als der andere, d. h. ein Kreis befindet sich innerhalb des anderen, mit der Zelle in der Mitte des kleineren Kreises. Der um die Zelle gezeichnete Kreis erleichtert nach der Hybridisierung die Lokalisierung der Zelle.
  14. Den Objektträger für 5 Minuten in den mit Methanol befüllten Coplin-Färbetrog geben.
  15. Den Objektträger aus dem Methanol entnehmen und an der Luft trocknen lassen.
  16. Mit einer Noniusskala oder einem England-Finder auf dem Objekttisch die Zelle auf dem Mikroskop-Objektträger lokalisieren und die Zellposition notieren. Diese Koordinaten erleichtern nach der Hybridisierung die Lokalisierung der Zelle.
  17. Mit einem Permanentmarker auf den Boden des Mikroskop-Objektträgers um die Zelle einen weiteren kleinen Kreis zeichnen. Dieser kennzeichnet den Bereich, in den die Sonde zu geben ist.

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