Paraffin-Vorbehandlungskit 3

 

Das Kurzprotokoll ist kein Ersatz für die Packungsbeilage.

Anwendungsgebiet
Vorbereitung paraffineingebetteter Gewebeschnitte auf positiv geladenen Objektträgern für den Einsatz in der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)* mit Vysis Multi-color FISH-DNA-Sonden 

Zusammenfassung und Prinzip
Das folgende Verfahren ist darauf ausgelegt, die Gewebeverarbeitbarkeit und die Permeabilität für das FISH-Verfahren zu maximieren, wenn Vysis Multi-color FISH-DNA-Sonden (z. B. ProVysionTM Multi-color Sonde, Bestellnr. 32-131090) verwendet werden. Dieser Vorbehandlungsassay trägt dazu bei, dass nach der Hybridisierung der DNA-Sonde möglichst wenige Partikel im Hintergrund vorliegen, da es bei bestimmten Gewebetypen gelegentlich zu einer Partikelanhäufung kommen kann.
paraffin-pretreatment-3-table.gif

Vorbereitung von Objektträgern mit Probe
Hinweis: Verwenden Sie Proben, die 24 bis 48 Stunden in Formalin fixiert wurden.

  1. Mit einem Mikrotom 4 bis 5 µm dicke paraffineingebettete Schnitte zuschneiden.
  2.  Die Schnitte auf ein 40 °C warmes Wasserbad (z. B. mit dreifach destilliertem Wasser) setzen, sodass sie oben schweben.
  3. Einen Schnitt auf einen positiv geladenen Objektträger geben.
  4. Die Objektträger an der Luft trocknen lassen und über Nacht bei 56 °C backen.

Entparaffinierung der Objektträger

  1. Die Objektträger 5 Minuten in raumwarmes Hemo-De eintauchen.
  2. Schritt 1 zweimal wiederholen und dabei jedes Mal frisches Hemo-De verwenden.
  3. Die Objektträger 1 Minute in raumwarmem 100 %igem EtOH dehydrieren. Wiederholen.
  4. Die Objektträger bei Bedarf 2 bis 5 Minuten an der Luft trocknen lassen.

Objektträger-/Protease-Vorbehandlung

  1. Die Objektträger 15 Minuten in eine raumwarme Lösung aus 45 %iger Ameisensäure/0,3 %igem Wasserstoffperoxid eintauchen.
  2. Die Objektträger 3 Minuten in gereinigtes Wasser eintauchen. Zum Aufsaugen von überschüssigem Wasser ein Papiertuch an die Kanten der Objektträger halten.
  3. Die Objektträger 10 Minuten in 80°C warme Vorbehandlungslösung eintauchen.
  4. 3 Minuten mit frischem gereinigtem Wasser spülen.
  5. In 37 °C warmer Protease-Arbeitslösung 10 Minuten inkubieren. 50 ml Protease-Puffer III (EXAKT) abmessen und in ein 37 ± 1 °C warmes Wasserbad geben. Darauf achten, dass die Temperatur des Puffers vor dem Gebrauch 37 ± 1 °C beträgt. Die Protease-Stammlösung vorbereiten. Hierzu 9,0 mg (ein Röhrchen) Protease zu 515 µl gereinigtem Wasser geben.

    Herstellung der Protease-Arbeitslösung
    100 &mgr;l Protease-Stammlösung in die (erwärmte) Flasche mit (einem genau abgemessenen Volumen von) 50 ml Protease-Puffer III pipettieren. Die verbliebene Protease-Stammlösung einfrieren.
  6. Zum Stoppen der Reaktion 3 Minuten in Protease-Stopplösung inkubieren.
  7. Die Objektträger in gereinigtem Wasser 3 Minuten spülen.
  8. Die Objektträger 2 bis 5 Minuten an der Luft trocknen lassen.
  9. Mit dem entsprechenden Vysis Sondenprotokoll fortfahren.

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