Paraffin-Vorbehandlungskit 2

Das Kurzprotokoll ist kein Ersatz für die Packungsbeilage.

Anwendungsgebiet

Vorbereitung von paraffineingebetteten, auf positiv geladenen Objektträgern fixierten Gewebeschnitten für den Einsatz in der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)* mit Vysis Multi-color FISH-DNA-Sonden

Zusammenfassung und Prinzip

Das folgende Verfahren dient der Maximierung der Gewebepermeabilität für das FISH-Verfahren bei der Verwendung von Vysis Multi-color FISH-DNA-Sonden.

Im Lieferumfang des Kits enthaltene Reagenzien    Kit-Bestellnr. 32-801210    Zur Anwendung im Labor

Reagenz Menge Zusammensetzung Lagerung
Vorbehandlungslösung 5 x 50 ml Natriumthiocyanat (NaSCN) 2 bis 25 °C
Protease-Puffer II 5 x 62,5 ml 0,2 N HCl, pH-Wert 1,0 2 bis 25 °C
Protease 5 x 250 mg 2500 bis 3000 E/mg Protease, lyophilisiert -20 bis 8 °C

Erforderliche Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind

  • Absolutes Ethanol (EtOH)
  • Hemo-De Löschlösung (Scientific Safety Solvents, Bestellnr. HD-150)
  • Gereinigtes Wasser (destilliert oder entionisiert)
  • Coplin-Färbetröge (16 Objektträger/8 Fächer Kapazität)
  • 37 °C und 80 °C warme Wasserbäder (eines mit einer Temperatur von 73 °C für den Sonden-Assay)

 

Vorbereitung von Objektträgern mit Probe

Hinweis: Verwenden Sie Proben, die 24 bis 48 Stunden in Formalin fixiert wurden.

  1. Mit einem Mikrotom 4 bis 5 µm dicke paraffineingebettete Schnitte zuschneiden.
  2. Die Schnitte auf ein 40 °C warmes Wasserbad (z. B. mit dreifach destilliertem Wasser) setzen, sodass sie oben schweben.
  3. Einen Schnitt auf einen positiv geladenen Objektträger geben.
  4. Die Objektträger an der Luft trocknen lassen.
  5. Die Objektträger über Nacht bei 56 °C backen.

 

Entparaffinierung der Objektträger

  1. Die Objektträger 5 Minuten in raumwarmes Hemo-De eintauchen.
  2. Schritt eins (1) zweimal wiederholen und dabei jedes Mal frisches Hemo-De verwenden.
  3. Die Objektträger 1 Minute in raumwarmem 100 %igem EtOH dehydrieren. Wiederholen.
  4. Die Objektträger bei Bedarf 2 bis 5 Minuten an der Luft trocknen lassen.

 

Vorbehandlung der Objektträger

  1. Die Objektträger 10 Minuten in 80 °C warme Vorbehandlungslösung eintauchen. Bei Bedarf können in jedes Fach des Coplin-Färbetrogs zwei Objektträger Rückseite-an-Rückseite eingesetzt werden, wobei in jedes der Endfächer ein Objektträger eingesetzt wird. Bei den an den Enden befindlichen Objektträgern muss die Seite des Objektträgers, auf der sich der Gewebeschnitt befindet, zur Mitte des Trogs zeigen.
  2. Die Objektträger 3 Minuten in gereinigtes Wasser eintauchen.

 

Protease-Vorbehandlung

  1. Die Objektträger aus dem Behälter mit gereinigtem Wasser nehmen.
  2. Zum Aufsaugen von überschüssigem Wasser ein Papiertuch an die Kanten der Objektträger halten.
  3. Die Objektträger 15 Minuten in 37 °C warme Proteaselösung eintauchen. (Darauf achten, dass die Temperatur des Puffers vor der Zugabe der 250 mg (ein Röhrchen) Protease 37 ± 1 °C beträgt.) Bei Bedarf können in jedes Fach des Coplin-Färbetrogs zwei Objektträger Rückseite-an-Rückseite eingesetzt werden, wobei in jedes der Endfächer ein Objektträger eingesetzt wird. Bei den an den Enden befindlichen Objektträgern muss die Seite des Objektträgers, auf der sich der Gewebeschnitt befindet, zur Mitte des Trogs zeigen.
  4. Die Objektträger 3 Minuten in gereinigtes Wasser eintauchen.
  5.  Die Objektträger 2 bis 5 Minuten an der Luft trocknen lassen.

 

Fixierung der Probe

Hinweis: Die Fixierung der Probe dient der Minimierung des Gewebeverlusts während der Denaturierung. Dieses Verfahren wird dringend empfohlen, wenn Proben in einem Wasserbad denaturiert werden.

  1. Einen (1) Coplin-Färbetrog mit 50 ml 10 %igem gepuffertem Formalin füllen. Drei (3) weitere Coplin-Färbetröge mit 50 ml 70 %igem Ethanol, 85 %igem Ethanol bzw. 100 %igem Ethanol füllen.
  2. Die Objektträger 10 Minuten in raumwarmes, 10 % gepuffertes Formalin eintauchen.
  3. Die Objektträger 3 Minuten in gereinigtes Wasser eintauchen.
  4. An der Luft trocknen lassen.
  5. Mit dem entsprechenden Vysis Sondenprotokoll fortfahren.

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