Paraffin-Vorbehandlung

Das Kurzprotokoll ist kein Ersatz für die Packungsbeilage.

Anwendungsgebiet

Vorbereitung von paraffineingebetteten, auf positiv geladenen Objektträgern fixierten Gewebeschnitten für den Einsatz in der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)* mit Vysis Sonden

Im Lieferumfang enthaltene Reagenzien

Reagenz Menge Zusammensetzung Lagerung
Vorbehandlungslösung 5 x 50 ml Natriumthiocyanat (NaSCN) 2 bis 25 °C
Protease-Puffer 5 x 50 ml NaCl, pH-Wert 2,0 2 bis 25 °C
Spülpuffer 5 x 250 mg 2x SSC, pH-Wert 7,0 2 bis 25 °C
Protease 5 x 25 mg 2500 bis 3000 E/mg Protease, lyophilisiert –20 °C

Vorbereitung der Objektträger mit Proben (optional)

Hinweis: Verwenden Sie Proben, die 24 bis 48 Stunden in Formalin fixiert wurden.

  1. Mit einem Mikrotom 4 bis 5 µm dicke paraffineingebettete Schnitte zuschneiden.
  2. Die Schnitte auf ein 40 °C warmes Wasserbad (z. B. mit dreifach destilliertem Wasser) setzen, sodass sie oben schweben.
  3. Einen Schnitt auf einen positiv geladenen Objektträger geben.
  4. Die Objektträger an der Luft trocknen lassen.
  5. Die Objektträger über Nacht bei 56 °C backen.

Entparaffinierung der Objektträger

  1. Die Objektträger 10 Minuten in raumwarmes Hemo-De eintauchen.
  2. Schritt 1 zweimal wiederholen und dabei jedes Mal neues Hemo-De verwenden.
  3. Die Objektträger bei Raumtemperatur 5 Minuten in 100 %igem EtOH dehydrieren. Wiederholen.
  4. Die Objektträger an der Luft trocknen lassen oder für 2 bis 5 Minuten auf einen 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer stellen.

Vorbehandlung der Objektträger

  1. Die Objektträger 20 Minuten in 0,2 N HCl eintauchen.
  2. Die Objektträger 3 Minuten in gereinigtes Wasser eintauchen.
  3. Die Objektträger 3 Minuten in Waschpuffer eintauchen.
  4. Die Objektträger 30 Minuten in 80 °C warme Vorbehandlungslösung eintauchen. In jedes Fach des Coplin-Färbetrogs können zwei Objektträger Rückseite-an-Rückseite eingesetzt werden, wobei in jedes der Endfächer ein Objektträger eingesetzt wird. Bei den an den Enden befindlichen Objektträgern muss die Seite des Objektträgers, auf der sich der Gewebeschnitt befindet, zur Mitte des Trogs zeigen. 
  5. Die Objektträger 1 Minute in gereinigtes Wasser eintauchen.
  6. Die Objektträger 5 Minuten in Waschpuffer eintauchen. Den Vorgang unter Verwendung des zweiten Waschpufferbehälters wiederholen.

Behandlung von Objektträgern mit Protease

  1. Die Objektträger aus dem zweiten Spülpufferbehälter nehmen.
  2. Zum Aufsaugen von überschüssigem Puffer ein Papiertuch an die Kanten der Objektträger halten.
  3. Die Objektträger 10 Minuten in 37 °C warme Proteaselösung eintauchen. (Darauf achten, dass die Temperatur des Puffers vor der Zugabe der 25 mg (ein Röhrchen) Protease 37 ± 1 °C beträgt.)
  4. Die Objektträger 5 Minuten in Waschpuffer eintauchen. Den Vorgang unter Verwendung des zweiten Waschpufferbehälters wiederholen.
  5. Die Objektträger auf einem 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer 2 bis 5 Minuten trocknen lassen.

Fixierung der Probe

  1. Die Objektträger 10 Minuten in raumwarmes, 10 % gepuffertes Formalin eintauchen.
  2. Die Objektträger 5 Minuten in Waschpuffer eintauchen. Den Vorgang unter Verwendung des zweiten Waschpufferbehälters wiederholen.
  3. Die Objektträger auf einem 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer 2 bis 5 Minuten trocknen lassen.
  4. Mit dem entsprechenden Vysis Sondenprotokoll fortfahren.

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