Vorbereitung von Lymphozyten: Vorbereitung der Kultur

Vorbereitung von Lymphozyten: Vorbereitung der Kultur
  1. 8 bis 10 ml peripheres Blut in ein 10 ml-Vacutainer-Röhrchen mit grünem Verschluss und dem Konservierungsmittel Natriumheparin ziehen. Gut mischen.
  2. Unter aseptischen Bedingungen den Inhalt des Vacutainer-Röhrchens in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen übertragen.
  3. Die Probe 10 Minuten lang bei 2.000 U/min in einer Tischzentrifuge zentrifugieren.
  4. Die Plasmaschicht vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette entfernen. Die Plasmaschicht gemäß den Laborverfahren zur Entsorgung von biologischem Material verwerfen.
  5. Den Buffy-Coat durch vorsichtige kreisförmige Bewegungen in der Schicht entfernen und gleichzeitig die Leukozyten in eine Pasteur-Pipette ziehen. Einige Erythrozyten und etwas Plasma werden ebenfalls eingezogen. Die Anzahl der Erythrozyten minimieren.
  6. Den Buffy-Coat in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen mit 1,5 ml cRPMI geben.
  7. Das entsprechenden Volumen der Erythrozyten-Suspension in 25 cm2-Kolben mit 10 ml cRPMI aliquotieren. 
  8. Jedem Kolben 0,2 ml PHA hinzufügen, fest verschließen und anschließend wieder leicht lösen, damit CO2 in den Kolben eindringen kann.
  9. Die Kultur inkubieren:

Zur Verwendung bei der FISH-Objektträgervorbereitung ...

Bei diesem Verfahren entstehen Chromosomen mit einer Bandenauflösung von 400 bis 450, die für die meisten FISH-Anwendungen ausreichend ist. 

    • Die Kultur bei 37 ± 1 °C in einer Umgebung mit 5 % CO2 72 bis 96 Stunden lang inkubieren.

Zur Verwendung bei der CGH-Objektträgervorbereitung ...

Diese zusätzlichen Schritte erhöhen Chromosomendehnung und den Mitoseindex. Für CGH müssen die Chromosomen eine Bandenauflösung von 400 bis 550 aufweisen.

    • Die Kultur bei 37 ± 1 °C in einer Umgebung mit 5 % CO2 48 bis 72 Stunden lang inkubieren.
    • 0,2 ml Thymidin in jeden Kolben geben und vorsichtig mischen.
    • Die Zellkultur 14 bis 18 Stunden lang inkubieren.
    • Die Kultur in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen übertragen.
    • 10 Minuten lang mit 1000 U/min zentrifugieren.
    • Den Überstand abgießen und 10 ml PBS hinzufügen.
    • 10 Minuten lang mit 1000 U/min zentrifugieren.
    • Den Überstand abgießen und jedem Röhrchen 10 ml cRPMI hinzufügen.
    • Die Zellkultur 4 bis 5 Stunden lang inkubieren.
 
 
 
 
Ernten der Zellkultur
  1. 8 bis 10 ml peripheres Blut in ein 10 ml-Vacutainer-Röhrchen mit grünem Verschluss und dem Konservierungsmittel Natriumheparin ziehen. Gut mischen.
  2. Unter aseptischen Bedingungen den Inhalt des Vacutainer-Röhrchens in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen übertragen.
  3. Die Probe 10 Minuten lang bei 2.000 U/min in einer Tischzentrifuge zentrifugieren.
  4. Die Plasmaschicht vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette entfernen. Die Plasmaschicht gemäß den Laborverfahren zur Entsorgung von biologischem Material verwerfen.
  5. Den Buffy-Coat durch vorsichtige kreisförmige Bewegungen in der Schicht entfernen und gleichzeitig die Leukozyten in eine Pasteur-Pipette ziehen. Einige Erythrozyten und etwas Plasma werden ebenfalls eingezogen. Die Anzahl der Erythrozyten minimieren.
  6. Den Buffy-Coat in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen mit 1,5 ml cRPMI geben.
  7. Das entsprechenden Volumen der Erythrozyten-Suspension in 25 cm2-Kolben mit 10 ml cRPMI aliquotieren.
  8. Jedem Kolben 0,2 ml PHA hinzufügen, fest verschließen und anschließend wieder leicht lösen, damit CO2 in den Kolben eindringen kann.
  9. Die Kultur inkubieren:

Zur Verwendung bei der FISH-Objektträgervorbereitung ...

Bei diesem Verfahren entstehen Chromosomen mit einer Bandenauflösung von 400 bis 450, die für die meisten FISH-Anwendungen ausreichend ist. 

    • Die Kultur bei 37 ± 1 °C in einer Umgebung mit 5 % CO2 72 bis 96 Stunden lang inkubieren.

Zur Verwendung bei der CGH-Objektträgervorbereitung ... 

Diese zusätzlichen Schritte erhöhen Chromosomendehnung und den Mitoseindex. Für CGH müssen die Chromosomen eine Bandenauflösung von 400 bis 550 aufweisen.

    • Die Kultur bei 37 ± 1 °C in einer Umgebung mit 5 % CO2 48 bis 72 Stunden lang inkubieren.
    • 0,2 ml Thymidin in jeden Kolben geben und vorsichtig mischen.
    • Die Zellkultur 14 bis 18 Stunden lang inkubieren.
    • Die Kultur in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen übertragen.
    • 10 Minuten lang mit 1000 U/min zentrifugieren.
    • Den Überstand abgießen und 10 ml PBS hinzufügen.
    • 10 Minuten lang mit 1000 U/min zentrifugieren.
    • Den Überstand abgießen und jedem Röhrchen 10 ml cRPMI hinzufügen.
    • Die Zellkultur 4 bis 5 Stunden lang inkubieren. 
 
 
 
 
Fixierung der Probe
  1. Langsam 2 ml Carnoy'sches Fixiermittel auf die Innenseite des Zentrifugenröhrchen auftragen.
  2. Das Zentrifugenröhrchen vorsichtig antippen, um die Zellpellet-Suspension mit dem Fixiermittel zu mischen.
  3. Langsam weitere 6 ml Carnoy'sches Fixiermittel in jedes Röhrchen geben.
  4. Jedes Röhrchen fest verschließen und zum Mischen mehrmals umdrehen. 
  5. Die Suspension 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen lassen und dann 10 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugieren.
  6. Den Überstand bis zur 1,5 ml-Markierung auf dem Zentrifugenröhrchen aspirieren, dabei darauf achten, das Zellpellet auszusparen.
  7. Das Zentrifugenröhrchen vorsichtig antippen, um das Pellet zu lösen.
  8. Die folgenden Schritte dreimal ausführen:
    • Langsam 10 ml Carnoy'sches Fixiermittel in jedes Zentrifugenröhrchen geben.
    • Jedes Röhrchen fest verschließen und zum Mischen umdrehen. 
    • Die Suspension 10 Minuten lang mit 1000 U/min zentrifugieren.
    • Den Überstand bis zur 1,5 ml-Markierung auf dem Zentrifugenröhrchen aspirieren, dabei darauf achten, das Zellpellet auszusparen.
    • Das Zentrifugenröhrchen vorsichtig antippen, um das Pellet zu lösen.
  9. Jeder Suspension langsam Carnoy'sches Fixiermittel hinzufügen, sodass eine leicht trübe Suspension entsteht, und vorsichtig vermischen.

 

Hinweis: Dem Zellpellet Fixiermittel hinzufügen, bis die Suspension leicht trüb ist. Die benötigte Fixiermittelmenge hängt von der Größe des Zellpellets ab. 

 

Zellen können bis zum Gebrauch bei 4 °C in fest verschlossenen Zentrifugenröhrchen aufbewahrt werden. Wenn die Objektträger nicht innerhalb von 7 TAGEN vorbereitet werden, das Gesamtvolumen auf 10 ml erhöhen und bei -20 °C einfrieren. Die in den Schritten 8a bis 8e beschriebene Spülung vor der Vorbereitung der Objektträger zweimal wiederholen.

 
 
 
 

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