LSI: Wichtige Produktinformationen

LSI: Wichtige Produktinformationen

 

1. Vorbereitung von Sonden

vysis-lsi-key-product-information-step-1.gif
  • Bei Raumtemperatur 7 µl CEP-Hybridisierungspuffer, 1 &mgr;l CEP-DNA-Sonde und 2 &mgr;l gereinigtes H2O mischen.*
  • 1 bis 3 Sekunden zentrifugieren, im Vortex mischen und anschließend erneut zentrifugieren.
  • In einem 73 °C warmen Wasserbad 5 Minuten erwärmen.
  • Auf einem Objektträgerwärmer, der auf 45 bis 50 °C eingestellt ist, platzieren.

 

2. Vorbereitung von Objektträgern

  • Die Hybridisierungsbereiche mit einem Marker mit Diamantspitze markieren.vysis-lsi-key-product-information-step-2.gif
  • Den Objektträger 5 Minuten in das 73 +/– 1 °C warme Denaturierungsbad (70 % Formamid/2x SSC) eintauchen. Wenn die Chromosomenmorphologie in der Metaphase problematisch ist, liefert eine Denaturierungstemperatur von 70 bis 73 °C ggf. bessere Ergebnisse.
  • Den Objektträger 1 Minute in 70 % EtOH, 1 Minute in 85 % EtOH und 1 Minute in 100 % EtOH dehydrieren.
  • Den Objektträger abtrocknen und bis zu 2 Minuten auf einem 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer platzieren.

 

3. Hybridisierung

  • 10 µl des Sondengemischs auf den Objektträger geben. Sofort nach dem Aufbringen der Sonde auf den Objektträger das Deckglas aufsetzen lsi-key-product-information-step-3.gifund das Deckglas mit verdünntem Kautschukkleber versiegeln.
  • Den Objektträger in einen vorgewärmten feuchten Behälter setzen und in einem 37 °C warmen Inkubator über Nacht 12 bis 16 Stunden hybridisieren lassen.
  • Einen Spülbehälter mit 0,4x SSC/0,3 % NP-40 vorbereiten und mindestens 30 Minuten in das 73 +/– 1 °C warme Wasserbad stellen. Nach 1 Tag der Verwendung entsorgen. Bei Raumtemperatur einen zweiten Behälter mit 2x SSC/0,1 % NP-40 vorbereiten.
  • Die Kautschukkleberversiegelung und das Deckglas entfernen und den Objektträger sofort in den Spülbehälter (0,4x SSC/0,3 % NP-40) setzen und 1 bis 3 Sekunden auf- und abbewegen. Den Vorgang für maximal drei weitere Objektträger wiederholen und alle Objektträger anschließend 2 Minuten in die Coplin-Färbeküvette setzen. Die Deckgläser erst unmittelbar vor dem Einsetzen in das Wasserbad von den Objektträgern abnehmen. Mit der Messung der Inkubationsdauer beginnen, sobald der letzte Objektträger in das Wasserbad gesetzt wurde.
  • Jeden Objektträger beim Einsetzen in das Wasserbad 1 bis 3 Sekunden auf- und abbewegen und bei Raumtemperatur 5 Sekunden bis 1 Minute in 2x SSC/0,1 % NP-40 spülen.
  • Die Objektträger an einem dunklen Ort lufttrocknen lassen.

 

 

4. Interpretation

vysis-lsi-key-product-information-step-4.gif
  • 10 &mgr;l DAPI-II-Gegenfärbung auf den Zielbereich des Objektträgers geben und das Deckglas aufsetzen.
  • Den Objektträger unter Anwendung eines geeigneten Filtersatzes betrachten.

 

 

 

5. Lagerung

vysis-products-cep-protocol-5.gif
  • Die Objektträger bei –20 °C an einem dunklen Ort lagern.
 
 
 
 
LSI: Verfahrenshinweise

 

Fluorophore neigen zur Photobleichung, wenn sie Licht ausgesetzt werden. Zur Begrenzung dieses Fluoreszenzverlusts sind alle Lösungen, die Fluorophore enthalten, bei verringerter Lichtexposition zu handhaben. Dies schließt die Schritte ein, bei denen hybridisierte Objektträger gehandhabt werden. Alle Arbeitsschritte, die keine Beleuchtung erfordern (Inkubationsphasen, Spülvorgänge usw.) sind an einem dunklen Ort durchzuführen.

 

Die Verwendung eines kalibrierten Thermometers wird für die Messung der Lösungstemperaturen eindringlich empfohlen. 

 

Es wird empfohlen, Reagenzfläschchen vor dem Öffnen 2 bis 3 Sekunden in einer normalen Tischmikrozentrifuge zu zentrifugieren.

 

Die raumwarme Coplin-Färbeküvette mit der Denaturierungslösung ist ca. 30 Minuten vor jedem Gebrauch in ein 73 °C warmes Wasserbad zu geben.

 

Wenn mehr als vier Objektträger hybridisiert wurden, sind diese in mehr als nur einer Charge zu spülen. Die Temperatur der Spüllösung muss vor jeder Chargenspülung 73 +/– 1 °C betragen.

 

 
 
 
 
LSI: Vorbereitung von Arbeitsreagenzien

 

20x SSC (für 500 ml 20x SSC, pH-Wert 5,3

132 g 20x SSC zu 400 ml H2O geben und gründlich mischen. Bei Raumtemperatur unter Verwendung eines pH-Messgeräts und mithilfe von konzentriertem HCl einen pH-Wert von 5,3 erzeugen und dabei das Volumen erhöhen, bis das Endvolumen von 500 ml erreicht ist. Das Gemisch durch einen 0,45-&mgr;m-Porenfilter filtrieren. Die Lösung kann bis zu sechs Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.

 

2x SSC/0,1 % NP-40 (für 1 Liter)

100 ml 20x SSC (pH-Wert 5,3) zu 850 ml gereinigtem H2O geben. 1,0 ml NP-40 hinzugeben. Unter Verwendung eines pH-Messgeräts und mithilfe von NaOH einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5 erzeugen. H2O hinzugeben, bis das Endvolumen der Lösung von 1 Liter erreicht ist. Die Lösung kann bis zu sechs Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.  

 

Spüllösung aus 0,4x SSC/0,3 % NP-40

20 ml 20x SSC und 950 ml gereinigtes H2O gründlich mischen. 3 ml NP-40 hinzugeben. Gründlich mischen, bis das NP-40 aufgelöst ist. Mithilfe von NaOH einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5 erzeugen. Gereinigtes H2O hinzugeben, bis das Endvolumen der Lösung von 1 l erreicht ist. Bei Raumtemperatur lagern. Die Stammlösung entweder nach 6 Monaten entsorgen oder wenn die Lösung trüb oder kontaminiert erscheint.

 

Die Lösung kann bis zu sechs Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.



Denaturierungslösung (für 70 ml)

49 ml Formamid, 7 ml 20x SSC (pH-Wert 5,3) und 14 ml gereinigtes H2O in eine Coplin-Färbeküvette aus Glas geben und gründlich mischen. Bei Raumtemperatur unter Verwendung eines pH-Messgeräts verifizieren, dass der pH-Wert zwischen 7,0 und 8,0 liegt. Jede Charge an Denaturierungslösung kann sieben Tage verwendet werden und ist anschließend zu entsorgen. Zwischen den Einsätzen bei 4 °C lagern.

 

Ethanolspüllösungen 

Für Endkonzentrationen von 70 %, 85 % und 100 %. V/V-Verdünnungen mit 100 % Ethanol und H2O vorbereiten. Jede Verdünnung kann bis zu sieben Tage verwendet werden und ist anschließend zu entsorgen. Wenn die Lösung verdunstet oder sich weiter verdünnt, diese durch eine frische Lösung ersetzen. Zwischen den Einsätzen bei Raumtemperatur lagern.

 
 
 
 

You are about to exit the Abbott family of websites for a 3rd party website

Links which take you out of Abbott worldwide websites are not under the control of Abbott, and Abbott is not responsible for the contents of any such site or any further links from such site. Abbott is providing these links to you only as a convenience, and the inclusion of any link does not imply endorsement of the linked site by Abbott. The website that you have requested also may not be optimised for your screen size.

Do you wish to continue and exit this website?

Yes No

You are about to enter an Abbott country or region specific website.

Please be aware that the website you have requested is intended for the residents of a particular country or countries, as noted on that site. As a result, the site may contain information on pharmaceuticals, medical devices and other products or uses of those products that are not approved in other countries or regions.

Do you wish to continue and enter this website?

Yes No

You are about to enter an Abbott country or region specific website.

Please be aware that the website you have requested is intended for the residents of a particular country or countries, as noted on that site. As a result, the site may contain information on pharmaceuticals, medical devices and other products or uses of those products that are not approved in other countries or regions.

Do you wish to continue and enter this website?

Yes No