Reagenzien für Laborgeräte

Reagenzien für Laborgeräte

Erforderliche Materialien

 

Die folgenden Hilfsstoffe, Reagenzien und Geräte sind für FISH-Assays erforderlich.

  • 100 %iges Ethanol (EtOH)
  • Gereinigtes Wasser (destilliert oder entionisiert)
  • 12N HCl (zum Einstellen der pH-Werts der Spüllösungen)
  • 1N NaOH (zum Einstellen der pH-Werts der Spüllösungen)
  • 20x SSC (500 g) (Vysis Bestellnr. 32-804850)
  • NP-40 (Vysis Bestellnr. 32-804818)
  • Coplin-Färbetröge aus Glas
  • Kalibriertes Thermometer
  • DAPI I-Gegenfärbung (Vysis Bestellnr. 30-804830)
  • DAPI II-Gegenfärbung (Vysis Bestellnr. 30-804831)
  • Pinzette
  • Formamid, ultrareine Sorte (Vysis Bestellnr. US75828)
  • Graduierter Zylinder, 1.000 ml
  • Magnetrührer
  • Methanol (zur Objektträgervorbereitung)
  • Mikrozentrifuge
  • Mikroliter-Pipettenspitzen für Volumina von 1 bis 10 &mgr;l
  • Mikroliter-Pipettierer mit Kapazität von 1 bis 10 &mgr;l
  • pH-Messgerät
  • Vorgereinigte Mikroskopobjektträger aus Glas
  • Gereinigtes Wasser
  • Schaltuhr
  • Vortexmischer
  • Wasserbad (37 und 72 °C)

Reagenzien zur Vorbehandlung

  • Paraffin-Vorbehandlungs-Kit I (32-801200)
  • Paraffin-Vorbehandlungs-Kit II (32-801210)
  • Paraffin-Vorbehandlungs-Kit III (32-801230)

  

 
 
 
 
Vorbereiten der Reagenzien

Hinweis: Wenn nicht anderweitig angegeben, muss der pH-Wert dieser Lösungen bei Raumtemperatur gemessen werden. Wenn nicht anderweitig angegeben, ein pH-Messgerät mit Glaselektrode verwenden.

 

20x SSC-Lösung

 

132 g 20x SSC gründlich mit 400 ml gereinigtem H2O mischen. Den pH-Wert messen und mit HCI auf 5,3 einstellen. Gereinigtes H2O hinzufügen, bis das Endvolumen 500 ml erreicht. Bei Umgebungstemperatur lagern. Die Stammlösung nach 6 Monaten oder auch früher entsorgen, wenn die Lösung trüb erscheint oder kontaminiert ist.

 

 2x SSC-Lösung

 

100 ml 20x SSC (pH 5,3) gründlich mit 850 ml gereinigtem H2O mischen. Den pH-Wert messen und mit NaOH auf 7,0 ±0,2 einstellen. Gereinigtes H2O hinzufügen, bis das Endvolumen 1 Liter erreicht. Bei Umgebungstemperatur lagern. Die Stammlösung nach 6 Monaten oder auch früher entsorgen, wenn die Lösung trüb erscheint oder kontaminiert ist.

 

Denaturierungslösung (70 % Formamid/2x SSC)

 

49 ml ultrareines Formamid, 7 ml 20x SSC (pH 5,3) und 14 ml gereinigtes H2O in einen Coplin-Färbetrog aus Glas geben und gründlich mischen. Den pH-Wert mit pH-Indikatorstreifen messen und sicherstellen, dass er bei 7,0 bis 8,0 liegt. Zwischen den einzelnen Anwendungen abgedeckt bei 2 bis 8 °C aufbewahren. Nach 7 Tagen entsorgen.

 

0,4x SSC/0,3 % NP-40 Spüllösung

 

20 ml 20x SSC (pH 5,3) gründlich mit 950 ml gereinigtem H2O mischen. 3 ml NP-40 hinzufügen. Gründlich mischen, bis das NP-40 vollständig aufgelöst ist. Den pH-Wert messen und mit NaOH auf 7,0 bis 7,5 einstellen. Gereinigtes H2O hinzufügen, bis das Endvolumen der Lösung 1 Liter erreicht. Bei Umgebungstemperatur lagern. Die Stammlösung nach 6 Monaten oder auch früher entsorgen, wenn die Lösung trüb erscheint oder kontaminiert ist.

 

2x SSC/0,1 % NP-40-Spüllösung

 

100 ml 20x SSC (pH 5,3) gründlich mit 850 ml gereinigtem H2O mischen. 1 ml NP-40 hinzufügen. Den pH-Wert messen und mit NaOH auf 7,0 ±0,2 einstellen. Gereinigtes H2O hinzufügen, bis das Endvolumen 1 Liter erreicht. Bei Umgebungstemperatur lagern. Die Stammlösung nach 6 Monaten oder auch früher entsorgen, wenn die Lösung trüb erscheint oder kontaminiert ist.

 

Ethanollösungen (70 %, 85 %, 100 %)

 

v/v-Verdünnungen von 100 % Ethanol mit gereinigtem H2O vorbereiten. Zwischen den einzelnen Verwendungen dicht verschlossen bei Raumtemperatur lagern. Stammlösungen nach 6 Monaten entsorgen.

 

PBS

 

PBS durch Verdünnung von 20 ml PBS 10x mit 180 ml gereinigtem H2O herstellen. Bei Umgebungstemperatur lagern. Die Stammlösung nach 6 Monaten oder auch früher entsorgen, wenn die Lösung trüb erscheint oder kontaminiert ist.

 

RNase A-Stamm- und Arbeitslösungen

 

Eine Stammlösung aus 10 mg/ml RNase A (DNase-frei) in 2x SSC vorbereiten. Wenn die RNase nicht als DNase-frei gekennzeichnet ist, die RNase-Lösung 10 Minuten lang in ein kochendes Wasserbad geben, um die DNase zu inaktivieren. In Volumina von 10 µl aliquotieren und bei -20 °C in verschlossenen 1,0 ml-Röhrchen lagern. Bei der Verwendung die RNase-Lösung durch Auftauen der RNase-Stammlösung (10 mg/ml) im Röhrchen und direktes Hinzufügen von 990 µl 2x SSC mit pH 7,0 bis 7,4 zu den 10 µl im Röhrchen vorbereiten. Mit dem Vortexer mischen. Nicht wieder einfrieren und auftauen. Nach der Verwendung entsorgen.

 

Pepsin-Stamm- und -Arbeitslösungen

 

Eine 10 %ige Pepsin-Stammlösung durch Mischen von 0,1 Gramm Pepsin und 1 ml Wasser (vorgewärmt auf 37 °C) herstellen. In 35 &mgr;l-Volumina aliquotieren und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern. Für den Gebrauch eine 0,005 %ige Pepsin-Arbeitslösung durch Mischen von 35 &mgr;l der 10 %igen Pepsin-Stammlösung mit einer Lösung von 69,3 ml gereinigtem Wasser und 0,7 ml 1,0 N HCl herstellen, die in einem Coplin-Färbetrog auf 37 °C erwärmt wurde (mit einem 37 °C warmen Wasserbad).

 

Formaldehyd-Fixierungslösung

 

57,6 ml gereinigtes Wasser, 3,5 ml 1M MgCl2, 7 ml 10x PBS und 1,89 ml 37 %iges Formaldehyd mischen. Gut mischen. In einen Coplin-Färbetrog geben. Täglich frisch vorbereiten.

 
 
 
 

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