FISH, gefärbt mit PAP: Vorbereitung von Lösungen

FISH, gefärbt mit PAP: Vorbereitung von Lösungen
  • Pepsin-Stammlösung herstellen. Gefroren aufbewahren. 0,5 g Pepsin in 5 ml destilliertem Wasser auflösen. Die Konzentration des Pepsins beträgt 100 mg/ml.
  • Pepsin-Arbeitslösung (0,05 mg/ml) herstellen. 20 &mgr;l Pepsin-Stammlösung zu 40 ml von 10 mM HCl hinzufügen. Die Endkonzentration von Pepsin beträgt 0,05 mg/ml.
  • 1 % Formaldehyd-Fixierlösung (V = 400 ml). 10 ml 37%iges Formaldehyd mit 386 ml PBSx1 und 4 ml 100XMgCl2 mischen = 2 M MgCl2. Im Kühlschrank aufbewahren. Nach jeder Verwendung entsorgen. Lösung nach dem Gebrauch entsorgen.
 
 
 
 
Entfernen des Deckglases
  1. Objektträger ca. 48 Stunden lang bei Umgebungstemperatur oder bis die Deckgläser leicht entfernt werden können oder vom Objektträger abfallen, in Xylol einweichen.
  2. Objektträger 5 Minuten lang in frischem Xylol spülen. Es wird empfohlen, die dritte Xylol-Spülung über 5 Minuten in frischer Lösung vorzunehmen.
  3. Objektträger ca. 15 Minuten lang an der Luft trocknen lassen.
  4. Objektträger in einen Coplin-Färbetrog mit 95 % Ethanol geben. Kann mehrere Tage/Wochen lang im Kühlschrank gelagert werden.
  5. Objektträger in einem Coplin-Färbetrog mit 85 % Ethanol spülen, gefolgt vom Spülen in einem Coplin-Färbetrog mit 70 % Ethanol. Jeweils 5 Minuten lang spülen.
  6. Die Objektträger 15 bis 60 Minuten lang in 2x SSC inkubieren. Mit der Vorbehandlung gefolgt von FISH fortfahren.
 
 
 
 
Vorbehandlungsverfahren
  1. Objektträger 10 Minuten lang bei 37 °C in 2x SSC inkubieren.
  2. Objektträger 13 Minuten lang bei 37 °C in Pepsin-Arbeitslösung inkubieren.
  3. In PBS-X1 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Objektträger 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1 % Formaldehyd fixieren.
  5. Objektträger 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS X1 spülen.
  6. Mit der Denaturierung des Objektträgers gemäß FISH-Protokoll fortfahren.
 
 
 
 

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