FISH-Vorbehandlung

Das Kurzprotokoll ist kein Ersatz für die Packungsbeilage.

Anwendungsgebiet

Vorbereitung von auf Objektträgern fixierten Zellen für den Einsatz in der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit Vysis Sonden

Im Lieferumfang enthaltene Reagenzien

Reagenz Menge Zusammensetzung Lagerung
Pepsinpuffer 3 x 50 ml 10 mM HCl 2 bis 25 °C
Protease 3 x 25 mg 2500 bis 3000 E/mg Protease, lyophilisiert -20 bis 8 °C
PBS 2 x 250 ml  1x PBS 2 bis 25 °C
100x MgCl2 3 x 0,5 ml 2 M MgCl2 * 6 H2O 2 bis 25 °C
20x SSC 1 x 66 g Natriumchlorid und Natriumcitrat -25 bis 30 °C

Im Lieferumfang enthaltene Reagenzien
Erforderliche Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind

  • Absolutes Ethanol (EtOH)
  • 10 %ige gepufferte Formalinlösung
  • Carnoysches Fixiermittel (Methanol: Eisessig im Verhältnis 3:1)
  • Gereinigtes Wasser (destilliert oder entionisiert)
  • Coplin-Färbetröge
  • Konische 15 ml-Zentrifugenröhrchen
  • Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen (1,5 ml)
  • 37 °C warmes Wasserbad

 

Vorbehandlungsverfahren

  1. Die Objektträger bei Raumtemperatur vollständig trocknen lassen.
  2. Die Objektträger in 73 ± 1 °C warmes 2x SSC 2 Minuten eintauchen.
  3. Die Objektträger in 37 °C warme Proteaselösung 10 Minuten eintauchen. (Dabei darauf achten, dass die Temperatur des Puffers vor der Zugabe der 25 mg Protease (ein Röhrchen) 37 °C beträgt.)
  4. Die Objektträger in raumwarmem 1x PBS 5 Minuten spülen.
  5. Die Objektträger in raumwarmem 1 %igem Formaldehyd 5 Minuten fixieren. (12,5 ml 10 %iges neutrales gepuffertes Formalin, 37 ml 1x PBS und 0,5 ml 100x MgCl2 (ein Röhrchen) mischen.)
  6. Die Objektträger in raumwarmem 1x PBS 5 Minuten spülen.
  7. Zum Dehydrieren die Objektträger in raumwarme 70 %ige Ethanollösung eintauchen. Die Objektträger in der Ethanolspülung 1 Minute stehen lassen. Den Vorgang mit 85 %igem Ethanol und danach mit 100 %igem Ethanol wiederholen.
  8. Mit dem entsprechenden Vysis Sondenprotokoll fortfahren.

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