FISH-Verfahren bei aus Paraffin isolierten Zellkernen

  • Nützlich für Proben, die über längere Zeit fixiert waren oder die als FISH-Ziele schwierig zu verwenden sind, etwa Gehirnproben.
  • Einen 40 µm-Gewebeschnitt dreimal jeweils 10 Minuten lang mit Xylol (oder Histoclear) entparaffinieren.
  • Zweimal 5 Minuten lang in 100 % EtOH dehydrieren.
  • 2 Stunden lang bei 37 °C in 4 mg/ml Pepsin (Sigma P-7012, in 0,9 % NaCl, pH 1,5) inkubieren. Alle 30 Minuten vortexen.
  • Durch ein 40 µm-Nylonnetz filtern.
  • Bei 800 U/min (Standard-Tischgerät) 5 bis 10 Minuten lang zentrifugieren.
  • Pellet in PBS spülen und zweimal jeweils 5 bis 10 Minuten lang mit 800 U/min zentrifugieren.
  • Pellet in einem Mindestvolumen von PBS resuspendieren.
  • Zellkerne vortexen und auf FISHer Superfrost Plus (Bestellnr. 12-550-15) Objektträgern verteilen, Objektträger 10 Minuten lang bei 65 °C trocknen.
  • Objektträger in PBS spülen.
  • 1,5 Minuten lang in 0,01 % Triton 100 in PBS inkubieren.
  • Dreimal jeweils 3 Minuten lang in PBS spülen.
  • 5 Minuten lang in 0,3 mg/ml Pronase in 50 mM Tris/Cl pH 7,6, 5 mM EDTA inkubieren.
  • Dreimal 3 Minuten lang in 2 mg/ml Glycin in PBS inkubieren.
  • 5 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd in PBS inkubieren.
  • 3 Minuten lang in 2 mg/ml Glycin in PBS inkubieren.
  • Jeweils 3 Minuten lang in 30 %, 60 %, 80 %, 95 % und 100 % EtOH spülen.
  • An der Luft trocknen lassen.
  • Sonde und Ziel-DNA gleichzeitig 1 bis 3 Minuten lang in einem 90 °C heißen Ofen denaturieren.
  • Mindestens 1 Stunde lang oder über Nacht bei 37 ° in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
  • Jeweils 1 Minute lang in den folgenden Spüllösungen bei 45 °C spülen: 3 x 50 % Formamid/2x SSC, je eine Spülung in 2x SSC, 2X SSC/0,1 % NP-40, 2x SSC/0,1 % NP-40 (RT).
  • Dieses Protokoll erfordert Formamid und Xylol, die teratogen wirken. Im entsprechenden Sicherheitsdatenblatt finden Sie weitere Informationen.

 

Protokoll übermittelt von:

Dr. Rizwan Naaem –Direktor – Zytogenetik-Labor

Baystate Medical Center, Springfield, 1994 MA

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