FISH-Labor-Qualitätskontrolle

Diese Leitlinien wurden ursprünglich für den ProbeChek™ Kontrollobjektträger verfasst, stellen aber dennoch einen hervorragenden Ausgangspunkt für die Qualitätsprüfung von Laborverfahren mit CEP® oder LSI® Sensoren für Zählungen dar.

Verfahren zur CEP- oder LSI-Sondenhybridisierung müssen wie in der Packungsbeilage der Sonde angegeben durchgeführt werden. Es wird dringend empfohlen, optimal geeignete Fluoreszenzmikroskope, Filter und Verfahren zu verwenden, die in der Packungsbeilage der Sonde angegeben sind, sodass eine optimale Hybridisierung und die genaue Beurteilung und Interpretation der CEP- und LSI-Sondensignale mit den ProbeChek™ Kontrollen möglich ist. Die Proben müssen vor der Hybridisierung mit Phasenkontrastmikroskopie beurteilt werden, um zu prüfen, ob sie optimal für FISH geeignet sind. Die vorgeschlagenen Leitlinien für FISH-Objektträger sind unten angegeben:

  • Die Zellen müssen gleichmäßig auf dem Objektträger verteilt sein. Bereiche mit Zellverklumpung weisen auf eine schlechte Objektträger- oder Probenvorbereitung hin. Es sollten mindestens acht Zellen pro 400x-Feld (Gesamtvergrößerung) vorhanden sein. Weniger Zellen weisen darauf hin, dass die Zellkonzentration für die optimale Zählung zu niedrig ist. 
  • Zellkerne und Metaphasen-Chromosomen sollten keine helle Phase haben. Zellen mit heller Phase weisen auf suboptimale Bedingungen bei der Objektträgervorbereitung hin. Die Bedingungen der Objektträgervorbereitung müssen vor der Vorbereitung der Objektträger stets mit einer hochwertigen Lymphozytenpräparation optimiert werden.
  • Zellkerne und Metaphasen dürfen nicht von sichtbarem Zytoplasma umgeben sein. Zytoplasma kann die Hybridisierung beeinträchtigen und zu einer ineffizienten Hybridisierung und ungenauen Ergebnissen führen.

Jeder hybridisierte Objektträger sollte anhand von Qualitätsparametern, die vom Labor festgelegt wurden, beurteilt werden. Mit einem geeigneten Mikroskop, geeigneter Beleuchtung und geeigneten Filtern müssen die Spezifität der Hybridisierung, die Intensität des Sondensignals und das Verhältnis von Signal zu Hintergrundrauschen ermittelt werden, um zu bestimmen, ob sich die Hybridisierung optimal für die Analyse eignet. Mindestens 85 % aller Zellkerne im Zielbereich sollten einfach zählbar sein. Es darf nur minimales Hintergrund- oder fluoreszierendes „Rauschen“ des Kerns vorliegen. Die Sondensignale müssen bei einer minimalen 400-fachen Vergrößerung gut sichtbar sein. Die Mehrzahl der Kerne auf dem Objektträger darf nicht mit umgebenden Kernen verbunden und nicht von Zytoplasma bedeckt sein. Zahlreiche Bereiche von verklumpten Zellkernen (größer als drei Kerne zusammen) können die adäquate und homogene Kernverteilung, die zur genauen Zählung erforderlich ist, verhindern. Präparate, die diese Kriterien nicht erfüllen, dürfen nicht für die Signalzählung verwendet werden. Die Signalzählung muss für jede beurteilte Sonde separat durchgeführt werden. Jedoch ist es vertretbar, die CEP X- und CEP Y-Sonden gleichzeitig zu zählen.

 

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Empfohlenes Dokumentationsformat für die Objektträgervorbereitung und die Qualitätskontrolle bei In-situ-Hybridisierung

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