Filter- und Mikroskopgrundlagen

Grundlagen zu Filtern und Mikroskopen

Das wachsende Sortiment von Abbott Molecular an Einzel-, Doppel- und Tripelbandpass-Filtersets sorgt für scharfe, äußerst kontrastreiche Bilder der Reagenzien von Abbott Molecular. Durch die gleichzeitige Betrachtung von bis zu fünf verschiedenen Fluorophoren erweitern die Multibandpass-Filtersets die Einsatzmöglichkeiten der Verfahren der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), sodass ein einzelner Assay mehrere Ergebnisse gleichzeitig liefern kann. Jedes Filterset wurde für die Fluorophore von Abbott Molecular entwickelt und optimiert. Die Filtersets von Abbott Molecular sind für die gängigsten Mikroskopmodelle erhältlich, darunter die folgenden:

  • Olympus®
  • Zeiss®
  • Leitz/Leica®
  • Nikon® 
Bei Fragen zu den Kosten und der Verfügbarkeit von Filtern für Ihr Mikroskop wenden Sie sich bitte an den technischen Kundendienst.
 
 
 
 
Mikroskopiegrundlagen

Ein richtig konfiguriertes, gut instand gehaltenes Fluoreszenzmikroskop ist für optimale FISH-Ergebnisse unverzichtbar. Befolgen Sie bei der Bedienung und Pflege Ihres Mikroskops sorgfältig die Anweisungen des Herstellers.

 
 
 
 
Anregungslampe

Die Anregungslampe ist die Lichtquelle, durch die das Fluorophor dazu angeregt wird, ein Fluoreszenzsignal abzugeben. Die beiden wichtigsten Merkmale einer Anregungsquelle sind die Emissionsspektren und die Intensität. Damit Fluoreszenz entsteht, muss die Lampe innerhalb der Absorptionsmaxima der jeweiligen Fluorophore Licht emittieren. Je höher die Anregungsintensität ausfällt, desto heller ist auch die Fluoreszenz. Mit zunehmender Anregungsintensität photooxidieren oder -bleichen die Fluorophore allerdings auch umso schneller. Bei allen Lampen sind die Kompromisse zwischen der Helligkeit des zu untersuchenden Bilds und der Sichtbarkeitsdauer zu berücksichtigen. Vysis empfiehlt die Verwendung einer 100-Watt-Quecksilberdampflampe als Anregungsquelle.

 
 
 
 
Empfohlene Objektive für die In-situ-Hybridisierung
  • Für die Fluoreszenzmikroskopie optimierte Planobjektive mit großer numerischer Apertur (~1,3)
  • Objektive mit möglichst wenigen Linsenelementen und einer numerischen Apertur von mindestens 0,75
  • Nicht empfohlen: Objektive mit vielen Linsenelementen und einer numerischen Apertur von mindestens 0,75

 

 
 
 
 
Filtersets

Filtersets dienen der Betrachtung eines spezifischen Fluorophors oder einer spezifischen Kombination von zwei oder mehreren Fluorophoren. Ein Filterset für die Fluoreszenzmikroskopie besteht aus drei Elementen: einem Anregungsfilter für die Selektion der zur Anregung des Fluorophors verwendeten Wellenlängen; einem dichroitischen Spiegel (Strahlteiler oder pleochroitisch) zum Reflektieren des Anregungslichts auf das Objekt auf dem Objektträger, wobei ein Großteil des vom Objektträger zum Okular zurückgeworfenen Anregungslichts blockiert und das vom Fluorophor in der In-situ-Hybridisierung abgegebene Licht weitergeleitet wird; und einem abschließenden Emissionsfilter (Sperrfilter), der nur das vom Fluorophor abgegebene Licht weiterleitet und alle anderen Wellenlängen außerhalb des vorgegebenen Bereichs blockiert.

 
 
 
 
Einzelfluorophore

Filtersets

Filter lassen sich in drei Hauptklassen einteilen: Bandpassfilter, Langpassfilter oder Kurzpassfilter. Ein Bandpassfilter überträgt Wellenlängen innerhalb eines Wellenlängenbereichs mit jeweils einer unteren und einer oberen Wellenlängengrenze. Wellenlängen, die außerhalb des oberen und des unteren Grenzwerts liegen, werden mittels Absorption und/oder Reflexion blockiert. Der Bandpass bzw. die Bandbreite (BB) ist die bei 50 % des Übertragungsmaximums maximale Breite einer gegebenen Spitze in Nanometern (nm). Sie kann auch als FWHM (Halbwertsbreite) oder HPBW (Keulenbreite) bezeichnet werden. Ein Langpassfilter überträgt Wellenlängen, die über einem festgelegten Wert liegen, und blockiert Wellenlängen unter diesem Wert.

 

Ein Kurzpassfilter wirkt entgegengesetzt zum Langpassfilter: Er übermittelt demzufolge Wellenlängen, die unter einem festgelegten Wert liegen, und blockiert Wellenlängen über diesem festgelegten Wert. Zur Herstellung von Interferenzfiltern werden dünne Filme im Vakuum auf ein Glassubstrat aufgedampft. Diese dünnen Filme bestehen aus abwechselnden Schichten aus Metall oder Dielektrika mit hohem und niedrigem Brechungsindex. Interferenzfilter können sowohl als Kurzpassfilter als auch als Langpassfilter oder Bandpassfilter produziert werden. Farbglasfilter werden aus mit einem Farbstoff imprägnierten Glas hergestellt und sind normalerweise Langpass- oder Bandpassfilter. Die entsprechenden Filter können mehrere Farbglas- und/oder Interferenzelemente enthalten, die gestapelt und mithilfe von optischem Epoxidharz miteinander verbunden (laminiert) werden. Sobald ein Filter Interferenzelemente enthält, wird er als Interferenzfilter bezeichnet.

 

Interferenzfilter sind aufgrund ihrer engen Bandbreiten, ihrer hohen Übertragungseffizienz und den sehr strikt gesetzten Grenzwerten sehr beliebt. Diese Filter sind jedoch teurer, weniger langlebig und haben normalerweise ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis (S/R) als Farbglasfilter. Farbglasfilter haben in der Regel eine große Bandbreite (z. B. 40 nm beim anregbaren Stoff FITC), eine geringere Übertragungseffizienz und weniger klar definierte Ober- und Untergrenzen. Farbglasfilter werden verwendet, weil sie gut verfügbar, kostengünstiger und langlebiger sind. 

 

Anregungsfilter sind in der Regel Bandpassfilter. Anregungsfilter können sowohl Farbglas- als auch Interferenzfilter sein. Je größer die Bandbreite ist, desto größer ist auch die Anregungsenergie. Wenn die Bandbreite zunimmt, führt dies zu einem Anstieg der Emissionsintensität, jedoch auch zu einer höheren Wahrscheinlichkeit einer unspezifischen Autofluoreszenz.

 

Dichroitische Spiegel sind Interferenzfilter. Zur Herstellung von dichroitischen Spiegel kommt eine Dünnfilmntechnologie zum Einsatz. Da diese Filter für eine hohe Bildqualität jedoch dünn bleiben müssen, erhalten sie keine Schutzschicht aus laminiertem Deckglas. Ungeschützte dichroitische Spiegel sind sehr anfällig für Kratzer und Beschädigungen. Im Fall von Zeiss Axioline Filtern muss der Anwender bei der Montage der Filtersets vorsichtig sein und darf den dichroitischen Spiegel nur mit Handschuhen an den Kanten anfassen.

 

Emissionsfilter können Bandpass- oder Langpassfilter sein.

 

Dabei können die Emissionsfilter vom Farbglas- oder vom Interferenztyp sein. Langpassfilterfilter leiten am meisten Licht weiter, sodass die Bilder heller, aber auch rauschbehafteter sind, einen stärker sichtbaren Hintergrund und ein geringeres Signal/Rausch-Verhältnis (S/R) aufweisen. Diese Rauschzunahme und Hintergrundverstärkung resultieren aus Zellabfallstoffen, dem Mikroskop-Objektträger usw.

 
 
 
 

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