Zählrichtlinien

Zählrichtlinien

Interpretation der Ergebnisse

 

Nachfolgend finden Sie die Zählrichtlinien für CEP und LSI auf Interphase-Zellkernen. Anwender sind angehalten, diese Richtlinien umzusetzen und bei Bedarf zusätzliche Richtlinien festzulegen, um Zählpräzision, -genauigkeit und -reproduzierbarkeit im Labor zu erhöhen. Eine Methode zur Auswertung der CEP® und LSI® Zählung wird nachfolgend beschrieben. Diese oder eine andere Methode kann die Zählgenauigkeit und -reproduzierbarkeit erhöhen, sofern das Labor sie standardisiert.

  1. Zur Untersuchung der Zellverteilung den Zielbereich unter einem Objektiv mit geringer Vergrößerung betrachten.
  2. Im Ziel einen Bereich auswählen, in dem die Zellen gleichmäßig verteilt sind, aber noch eine Dichte aufweisen, bei der in einem Bildfeld mit 400-facher Vergrößerung mehrere Zellkerne sichtbar sind. Bereiche mit hoher Zellverteilungsdichte, überlappenden Zellkernen oder undefinierten Zellkernrändern vermeiden.
  3. Ein apochromatisches 40x- bis 100x-Ölimmersionsplanobjektiv verwenden und zunächst den oberen linken Quadranten des ausgewählten Bildfelds betrachten. Im ersten Bildfeld jeden einzelnen gültigen Zellkern betrachten und die Anzahl der Signale einer Sondenfarbe, die innerhalb des Zellkernrands liegen, zählen. Die Signale können hell sein und eine kompakte ovale Form aufweisen, in zwei kleinere verbundene Punkte gespalten sein oder eine strangartige diffuse Form aufweisen. Gespaltene oder fragwürdige Signale durch Beobachtung bei einer höheren Vergrößerung bewerten. Die Signalzahl jeder einzelnen Zelle notieren. Den Objektträger von links nach rechts (oder oben nach unten) weiter auf Felder mit auswertbaren Zellkernen untersuchen. Bei Erreichen des Randes eines sicht- oder auswertbaren Zellkerns zum nächsten Feld übergehen und mit der Untersuchung fortfahren. Diesen Untersuchungsvorgang wiederholen, bis die erforderliche Anzahl an Zellkernen ausgezählt wurde (200 bis 500 oder mehr, je nach Prävalenz der anomalen Zellen). Diesen Vorgang für jede weitere Sonde wiederholen, bis zu allen zu zählenden Sonden Daten vorliegen.
 
 
 
 
Einzelfarbzählung

Empfohlene Zählrichtlinien für die Einzelzählung von Farbsonden

Eine Einzelzählung von Farbsonden kann mit einem einzigen Bandpassfilter oder einem Multibandpass-Filterset durchgeführt werden, um die Fluoreszenz der Gegenfärbung (falls vorhanden) sichtbar zu machen.

  1. Zellen, die sich berühren oder überlagern, dürfen nicht ausgewertet werden.
  2. Diffuse Signale zählen, wenn diese von anderen Signalen getrennt sind.
  3. Gespaltene Signale – zwei kleinere, sehr nah beieinander liegende Signale – als ein Signal zählen. Die beiden Signale repräsentieren ein einzelnes Chromosomkomplement.
  4. Zwei Signale, die durch einen Fluoreszenzstrang verbunden sind, als ein Signal zählen.
  5. Zellen ohne Signal nur zählen, wenn diese von signalabgebenden Zellkernen umgeben sind.
  6. Zellkerne, die nicht intakt sind, dürfen nicht ausgewertet werden.
  7. Zellkerne mit überlappenden Signalen verschiedener Färbung dürfen nicht ausgewertet werden.
  8. Unspezifische Hybridisierungssignale dürfen nicht gezählt werden. Diese Signale lassen sich anhand ihrer geringeren Intensität und abweichenden Form erkennen.
  9. Zellkerne mit Signalen im peripheren Zellkernbereich dürfen nicht ausgewertet werden.
  10. Nur Zellkerne zählen, die sich eindeutig zählen lassen; alle anderen Zellkerne sind zu überspringen.
  11. Die Ergebnisse sorgfältig notieren. Zur Validierung fragwürdiger Ergebnisse die Zählung wiederholen.
fish-lab-quality-control-guidelines-for-single-color-enumeration.gif

 

 
 
 
 
Doppelfarbzählung

Zwei oder mehr Sonden, die mit verschiedenen Farbfluorophoren markiert sind und an dieselben Zellen hybridisiert werden, können entweder mit Einzelbandpass-Filtersets einzeln oder mit Multibandpass-Filtersets gleichzeitig gezählt werden, je nach Signalintensität der Sonden und Größe des Zellkerns. Aufgrund der räumlichen Position des Sondensignals im Zellkern oder von als gedämmt empfundenen Sondensignalen lassen sich Zellen mit kleinen oder eingeschnürten Kernen möglicherweise nicht ohne Weiteres zählen, wenn Multibandpass-Filtersets verwendet werden.

  1. Zellen, die sich berühren oder überlagern, dürfen nicht ausgewertet werden.
  2. Diffuse Signale zählen, wenn diese von anderen Signalen getrennt sind.
  3. Gespaltene Signale – zwei kleinere, sehr nah beieinander liegende Signale – als ein Signal zählen. Die beiden Signale repräsentieren ein einzelnes Chromosomkomplement.
  4. Zwei Signale, die durch einen Fluoreszenzstrang verbunden sind, als ein Signal zählen.
  5. Zellen ohne Signal nur zählen, wenn diese von signalabgebenden Zellkernen umgeben sind.
  6. Zellkerne, die nicht intakt sind, dürfen nicht ausgewertet werden.
  7. Zellkerne mit überlappenden Signalen verschiedener Färbung dürfen nicht ausgewertet werden.
  8. Unspezifische Hybridisierungssignale dürfen nicht gezählt werden. Diese Signale lassen sich anhand ihrer geringeren Intensität und abweichenden Form erkennen.
  9. Zellkerne mit Signalen im peripheren Zellkernbereich dürfen nicht ausgewertet werden.
  10. Nur Zellkerne zählen, die sich eindeutig zählen lassen; alle anderen Zellkerne sind zu überspringen.
  11. Die Ergebnisse sorgfältig notieren. Zur Validierung fragwürdiger Ergebnisse die Zählung wiederholen.
 
 
 
 

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