CGH-Nick-Translation: Vorbereiten der Reagenzien

CGH-Nick-Translation: Vorbereiten der Reagenzien

 

0,2 mM SpectrumGreen oder SpectrumRed dUTP

10 &mgr;l von 1 mM dUTP zu 40 &mgr;l nukleasefreiem Wasser hinzufügen.

 

0,1 mM dTTP

10 &mgr;l von 0,3 mM dTTP zu 20 &mgr;l nukleasefreiem Wasser hinzufügen.

 

0,1 mM dNTP-Mix

10 &mgr;l von jeweils 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP und 0,3 mm dGTP vermischen.

 

Extrahierte genomische DNA

0,2 &mgr;g/&mgr;l bis 1 &mgr;g/&mgr;l Lösung von extrahierter genomischer DNA in Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,5) zubereiten.

 
 
 
 
CGH-Nick-Translation: Assay-Verfahren

 

Mit diesem Verfahren werden circa 1 &mgr;g der extrahierten genomischen DNA markiert. Dies ist ausreichend für fünf CGH-Hybridisierungen.

  1. Ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis legen und das Röhrchen abkühlen lassen.
  2. Folgende Komponenten in der angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen geben:
    cgh-nick-translation-assay-procedure.gif
  3. Das Röhrchen kurz vortexen.
  4. 2 bis 4 Stunden lang bei 15 °C inkubieren.
  5. Die Reaktion durch 10-minütiges Erhitzen in einem 70 °C heißem Wasserbad stoppen.
  6. Auf Eis kühlen. 

Bestimmung der Sondengröße

Die Bestimmung der Sondengröße ist ein wesentlicher Bestandteil des CGH-Verfahrens. Detaillierte Anweisungen zur Vorbereitung und Durchführung eines Agarosegels siehe (1) Maniatis T, Fritsch EF, and Sambrook J. Gel electrophoresis of DNA. In: Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring, NY: Cold Spring Harbor Laboratory; 1989 oder (2) Ausubel FM, ed. Preparation and Analysis of DNA. In: Current Protocols in Molecular Biology. New York: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, 1989.

  1. Ein 1 %iges Agarosegel durch Hinzufügung von 1 g Agarose auf 100 ml TAE-Puffer zubereiten. Die Lösung in der Mikrowelle erwärmen, bis die Agarose geschmolzen ist. Diese Menge ist für drei Minigels ausreichend.
  2. Die Agaroselösung auf 55 °C abkühlen lassen und10 &mgr;l EtBr hinzufügen (die endgültige Konzentration beträgt 0,01 % (v/v)).
  3. Die aufgeschmolzene Agarose in eine Minigel-Kammer (10 cm x 6,5 cm) mit Kämmen gießen. Die Agarose abkühlen und fest werden lassen.
  4. So viel TAE-Laufpuffer n die Minigel-Kammer gießen, bis das Gel etwa 1 mm hoch bedeckt ist.
  5. 9 &mgr;l des Reaktionsgemisches der Nick-umgewandelten DNA entfernen und 1 µl Gelladepuffer hinzufügen.
  6. Die Nick-umgewandelte Probe in einer Spur, und eine Probe des DNA-Größenmarkers in einer anderen Spur durchlaufen lassen, um die Größe der Sonde anzupassen.
  7. Elektrophorese des Gels bei 10 V/cm durchführen, bis der Farbstoff im Gelladepuffer 2 bis 3 cm vom Ende des Gels entfernt ist.
  8. Die Größenspanne der Sonde aus dem Gel schätzen. Die meisten DNA-Ausstriche sollten im Bereich von 300 bis 3000 bp liegen. Größere Sondenfragmente erzeugen eine verminderte Fluoreszenzintensität bei Verwendung in einer CGH-Analyse. 

Je höher die Enzymmenge und Inkubationszeit, desto stärker verlagert sich die Größenverteilung zu immer kleineren Sondenfragmenten. Für kleinere Sondenfragmente die folgenden Bedingungen verwenden, die in der Reihenfolge abnehmender Fragmentgröße aufgelistet sind: 5 µl Enzymmischung/2 Stunden Inkubation, 5 &mgr;l Enzymmischung/4 Stunden Inkubation, 10 &mgr;l Enzymmischung/2 Stunden Inkubation und 10 &mgr;l Enzymmischung/4 Stunden Inkubation. Die Menge nukleasefreien Wassers so anpassen, dass das gesamte Reaktionsvolumen bei 50 &mgr;l verbleibt.

 
 
 
 

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