CGH-Hybridisierung: Vorbereiten der Reagenzien

CGH-Hybridisierung: Vorbereiten der Reagenzien

20x SSC, pH 5,3

66 g 20x SSC gründlich mit 200 ml gereinigtem H2O mischen. Den pH-Wert bei Umgebungstemperatur mit konzentriertem HCl auf 5,3 einstellen und das Endvolumen auf 250 ml bringen. Bei Umgebungstemperatur lagern. Die Stammlösung nach 6 Monaten oder auch früher entsorgen, wenn die Lösung trüb erscheint oder kontaminiert ist.

 

Denaturierungslösung

49 ml Formamid, 7 ml 20x SSC (pH 5,3) und 14 ml gereinigtes H2O in einen Coplin-Färbebehälter aus Glas geben und gründlich mischen. Durch Messung des pH-Werts bei Umgebungstemperatur prüfen, ob er bei 7,0 bis 7,5 liegt. Zwischen den Verwendungen abgedeckt bei 4 °C lagern. Nach 7 Tagen Verwendung entsorgen.

 

Ethanol-Spüllösungen (70 %, 85 % und 100 %)

Zur Vorbereitung der Spüllösungen 100 % Ethanol v/v mit gereinigtem H2O verdünnen. Zwischen den einzelnen Verwendungen abgedeckt bei Raumtemperatur lagern. Stammlösungen nach 6 Monaten entsorgen.

 

0,4x SSC/0,3 % NP-40 Spüllösung

20 ml 20x SSC gründlich mit 950 ml gereinigtem H2O mischen. 3 ml NP-40 hinzufügen. Gründlich mischen, bis das NP-40 aufgelöst ist. Den pH-Wert mit NaOH auf 7,0 bis 7,5 einstellen. Gereinigtes H2O hinzufügen, bis das Endvolumen 1 l erreicht. Bei Umgebungstemperatur lagern. Die Stammlösung nach 6 Monaten oder dann entsorgen, wenn die Lösung trüb erscheint oder kontaminiert ist.

 

2x SSC/0,1 % NP-40-Spüllösung

1 ml NP-40 hinzufügen. Den pH-Wert mit NaOH auf 7,0 bis 7,5 einstellen. Gereinigtes H2O hinzufügen, bis das Endvolumen 1 l erreicht. Bei Umgebungstemperatur lagern. Die Stammlösung nach 6 Monaten oder dann entsorgen, wenn die Lösung trüb erscheint oder kontaminiert ist.

 

Testen der DNA

Die Test- (und unmarkierte Kontroll-)DNA direkt mit SpectrumGreenTM dUTP markieren. Das Verfahren finden Sie unter der Beschreibung für das Vysis CGH Nick-Translations-Kit.

 
 
 
 
CGH-Verfahren

Kontrollen 

Positiv- und Negativkontrollen ermöglichen Vergleiche zur Bewertung der Hybridisierung und Auswertung von CGH-Daten. Bei einer Negativkontrolle normale DNA für den Test und als Referenz verwenden (Bestellnr. 32-804024, 32-802024). Die Intensitätsprofile für dieses Experiment sollten innerhalb der durch die Bildanalyse ermittelten Grenzwerte liegen. Bei einer Positivkontrolle Test-DNA verwenden (Bestnr. 32-800227), die aus einer Zelllinie mit bekannten genetischen Abweichungen, die in der CGH-Analyse leicht nachweisbar sind, extrahiert wurde.

 

Normale Metaphasen-CGH-Ziel-Objektträger

Objektträger nicht vorbehandeln. Objektträger mit standardmäßigen zytogenetischen Verfahren zur Objektträgervorbereitung, die für CGH optimiert sind, vorbereiten. Die Objektträger enthalten Phytohämagglutinin-(PHA)-stimulierte Lymphozyten, die 48 bis 72 Stunden lang kultiviert wurden, bevor Thymidin zur Synchronisierung der Zellen hinzugefügt wird. Die Chromosomenlänge beträgt 400 bis 550 Banden. Die Lymphozyten werden aus einem karyotypisch normalen, männlichen Spender gewonnen.

 

Vorbereitung der Sondenmischung

Zur Erzeugung einer Hybridisierung mit gleichermaßen für SpectrumGreenTM und SpectrumRedTM markierter DNA geeigneter Signalintensität wird die Menge der SpectrumGreen-markierten DNA erhöht.

  1. Die folgenden Bestandteile in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben:
    10 &mgr;l (200 ng) SpectrumGreen (Nick-Translations-markierte) Test-DNA 1 &mgr;l (100 ng) SpectrumRed Gesamtgenom-Referenz-DNA (Bestellnr. 32-804023 oder 32-804024) 10 &mgr;l (10 µg) humane COT-1-1-DNA (Bestellnr. 32-800028)
  2. 1 &mgr;l (0,1 Volumen) 3 M Natriumacetat, dann 52,5 µl (2,5 Volumina) von 100 % EtOH hinzufügen, sodass ein DNA-Präzipitat entsteht. Kurz vortexen und 15 Minuten lang auf Trockeneis legen.
  3. Mit 12.000 U/min und bei 4 °C 30 Minuten lang zentrifugieren, um die DNA zu pelletieren. 
  4. Den Überstand entfernen und das Pellet 10 bis 15 Minuten lang unter Vakuum bei Raumtemperatur trocknen.
  5. Das Pellet in 3 µl gereinigtem H2O und 7 &mgr;l CGH-Hybridisierungspuffer resuspendieren. Die Sonde durch 5 Minuten langes Erhitzen in einem 73 °C heißen Wasserbad denaturieren. HINWEIS: Die Sonde denaturieren, während der Objektträger dehydriert wird (Schritt 3 bei der Hybridisierung der Sonde zur Ziel-Metaphase).

Die Sonde zur Ziel-Metaphase hybridisieren. 

  1. Hybridisierungsbereiche auf dem Objektträger mit einem Marker mit Diamantspitze markieren.
  2. Sicherstellen, dass die Temperatur der Denaturierungslösung bei 73 ± 1 °C liegt. Den Objektträger mit normalen Metaphasen-Spreitungen 5 Minuten lang in die Lösung tauchen.
  3. Den Objektträger 1 Minute lang in der 70 %iger Ethanollösung, gefolgt von 1 Minute in 85 %iger Ethanollösung und 1 Minute in der 100 %iger Ethanollösung dehydrieren.
  4. Den Objektträger abtrocknen. Hierzu die untere Kante des Objektträgers an ein Löschpapier halten und anschließend die Unterseite mit einem Papiertuch abwischen.
  5. Den Objektträger auf einen 45 bis 50 °C warmen Objektträgerwärmer legen, damit verbleibendes EtOH verdunstet.
  6. 10 µl der denaturierten Sondenmischung auf den Objektträger geben. 
  7. Sofort ein Deckglas auflegen und mit verdünntem Kautschukkleber versiegeln.
  8. Den Objektträger in einen versiegelten, befeuchteten Behälter legen und zur Hybridisierung 48 bis 72 Stunden lang in einen 37 °C warmen Inkubator legen.

Spülen des Objektträgers 

  1. Den Spülbehälter mit 0,4x SSC/0,3 % NP-40 Spüllösung vor Gebrauch mindestens 30 Minuten lang in ein 74 ± 1 °C heißes Wasserbad legen. Nach 1 Tag Verwendung entsorgen. Einen zweiten Behälter mit 2x SSC/0,1 % NP-40 mit Umgebungstemperatur vorbereiten.
  2. Die Kautschukkleber-Dichtung und das Deckglas entfernen und den Objektträger sofort in die 0,4x SSC/0,3 % NP-40 Spüllösung mit 74 ± 1 °C legen. Den Objektträger 1 bis 3 Sekunden lang auf- und abbewegen.
  3. Schritt 2 für jeden Objektträger wiederholen – nicht mehr als vier Objektträger gleichzeitig spülen – und dann die Objektträger 2 Minuten lang stehen lassen.
  4. Den Objektträger in die 2x SSC/0,1 % NP-40 Spüllösung mit Raumtemperatur legen. Den Objektträger 1 bis 3 Sekunden lang auf- und abbewegen und anschließend 5 Sekunden bis 1 Minute lang stehen lassen.
  5.  Objektträger im Dunkeln an der Luft trocknen lassen.

Visualisierung der Hybridisierung

Auf jeden Hybridisierungsbereich 10 &mgr;l DAPI II-Gegenfärbung auftragen und ein Deckglas auflegen.

 

 
 
 
 

You are about to exit the Abbott family of websites for a 3rd party website

Links which take you out of Abbott worldwide websites are not under the control of Abbott, and Abbott is not responsible for the contents of any such site or any further links from such site. Abbott is providing these links to you only as a convenience, and the inclusion of any link does not imply endorsement of the linked site by Abbott. The website that you have requested also may not be optimised for your screen size.

Do you wish to continue and exit this website?

Yes No

You are about to enter an Abbott country or region specific website.

Please be aware that the website you have requested is intended for the residents of a particular country or countries, as noted on that site. As a result, the site may contain information on pharmaceuticals, medical devices and other products or uses of those products that are not approved in other countries or regions.

Do you wish to continue and enter this website?

Yes No

You are about to enter an Abbott country or region specific website.

Please be aware that the website you have requested is intended for the residents of a particular country or countries, as noted on that site. As a result, the site may contain information on pharmaceuticals, medical devices and other products or uses of those products that are not approved in other countries or regions.

Do you wish to continue and enter this website?

Yes No