CEP: Wichtige Produktinformationen

CEP: Wichtige Produktinformationen

 

1. Vorbereitung der Probe

  • Bei Raumtemperatur 7 µl CEP-Hybridisierungspuffer, 1 &mgr;l CEP DNA-Sonde und 2 &mgr;l gereinigtes H2O mischen.*vysis-products-cep-protocol-1.gif
  • 1 bis 3 Sekunden lang zentrifugieren, vortexen und anschließend erneut zentrifugieren.
  • 5 Minuten lang in einem 73 °C heißen Wasserbad erwärmen und anschließend auf einen Objektträgerwärmer mit 45-50 °C legen.

*Für die gleichzeitige Hybridisierung zweier CEP-Sonden 7 µl CEP-Hybridisierungspuffer, 1 &mgr;l gereinigtes H2O und 1 &mgr;l jeder der beiden verschiedenen CEP-DNA-Sonden verwenden.

 

2. Vorbereitung der Objektträger

  • Hybridisierungsbereiche mit einem Marker mit Diamantspitze markieren. vysis-products-cep-protocol-2.gif
  • Den Objektträger 5 Minuten lang in ein 73 +/- 1 °C warmes Denaturierungsbad eintauchen (70 % Formamid/2x SSC).
  • Den Objektträger 1 Minute lang in 70 % EtOH, 1 Minute lang in 85 % EtOH und 1 Minute lang in 100 % EtOH dehydrieren.
  • Den Objektträger trocknen und bis zu 2 Minuten lang auf einen Objektträgerwärmer (45-50 °C) legen.

 

3. Hybridisierung

  • 10 µl der Probenmischung auf den Objektträger auftragen. Sofort nach der vysis-products-cep-protocol-3.gif Platzierung der Sonde auf dem Objektträger ein Deckglas auflegen. (Der Objektträger muss bei kurzen Hybridisierungen nicht versiegelt werden).
  • Den Objektträger in einem vorgewärmten, nicht befeuchteten Behälter platzieren und mindestens 30 Minuten lang (jedoch nicht länger als 60 Minuten) in einem 42 °C warmen Inkubator hybridisieren lassen.
  • Einen Spülbehälter mit 0,4x SSC/0,3 % NP-40 vorbereiten und mindestens 30 Minuten lang in das 73 +/- 1 °C heiße Wasserbad legen. Nach 1 Tag Verwendung entsorgen. Einen zweiten Behälter mit 2x SSC/0,1 % NP-40 mit Raumtemperatur vorbereiten.
  • Das Deckglas entfernen und die Probe sofort in einen Spülbehälter mit 0,4x SSC/0,3 % NP-40 legen und Objektträger 1 bis 3 Sekunden lang auf- und abbewegen. Den Vorgang für die anderen drei Objektträger wiederholen und alle vier Objektträger 2 Minuten lang in einen Coplin-Färbetrog legen
  • Den Objektträger in 2x SSC/0,1 % NP-40 bei Raumtemperatur 5 Sekunden bis 1 Minute lang spülen und beim Einlegen des Objektträgers in das Bad 1 bis 3 Sekunden lang auf- und abbewegen.
  • Objektträger im Dunkeln an der Luft trocknen lassen.

 

4. Interpretation

vysis-products-cep-protocol-4.gif
  • 10 &mgr;l DAPI II Gegenfärbung auf den Zielbereich des Objektträgers auftragen und ein Deckglas auflegen.
  • Den Objektträger mit einem geeigneten Filtersatz betrachten.

 

 

5. Lagerung vysis-products-cep-protocol-5.gif

  • Objektträger bei -20 °C im Dunkeln lagern. 
 
 
 
 
Hinweise zum CEP-Verfahren

 

Fluorophore neigen zur Photobleichung, wenn sie Licht ausgesetzt werden. Um diese Zersetzung zu begrenzen, alle Fluorophor-haltigen Lösungen bei reduziertem Licht handhaben, einschließlich der Schritte zur Handhabung von Objektträgern mit hybridisierten Proben. Alle Schritte, die keine Beleuchtung erfordern (Inkubation, Spülvorgänge usw.) im Dunkeln durchführen. 

 

Die Verwendung eines kalibrierten Thermometers wird dringend für die Temperaturmessung von Lösungen empfohlen. 

 

Vor dem ersten Öffnen jeder Reagenzphiole diese 2 bis 3 Sekunden lang mit einer standardmäßigen Tisch-Mikrozentrifuge zentrifugieren. 

 

Den Coplin-Färbetrog mit Raumtemperatur, der die Denaturierungslösung enthält, vor dem Gebrauch etwa 30 Minuten lang in ein 73+/-1 °C heißes Wasserbad geben. 

 

Wenn mehr als vier Objektträger hybridisiert wurden, müssen sie in mehreren Chargen gespült werden. Die Temperatur der Spüllösung muss vor dem Spülen jeder Charge wieder 73+/-1 °C erreichen.

 

 
 
 
 
CEP-Präparate von Arbeitsreagenzien

 

20x SSC (für 500 ml 20x SSC, pH 5,3) 

132 g 20x SSC zu 400 ml H2O hinzufügen und gründlich mischen. Den pH-Wert bei Raumtemperatur mit einem pH-Messgerät und konzentrierter Salzsäure auf 5,3 einstellen und das Endvolumen auf 500 ml bringen. Durch eine Filtereinheit mit 0,45 &mgr;m-Poren filtern. Die Lagerung ist bis zu sechs Monate bei Raumtemperatur möglich.

 

2x SSC/0,1 % NP-40 (für 1 Liter)

100 ml 20x SSC (pH 5,3) zu 850 ml gereinigtem H2O hinzufügen. 1,0 ml NP-40 hinzufügen. Den pH-Wert mit NaOH und einem pH-Messgerät auf 7,0 bis 7,5 einstellen. H2O hinzufügen, bis das Endvolumen der Lösung 1 Liter erreicht. Die Lagerung ist bis zu sechs Monate bei Raumtemperatur möglich.  

 

0,4x SSC/0,37 NP-40 Spüllösung 

H2O hinzufügen, bis das Endvolumen der Lösung 1 Liter erreicht. Durch eine Filtereinheit mit 0,45 &mgr;m-Poren filtern. Die Lagerung ist bis zu sechs Monate bei Raumtemperatur möglich. Hinweis: Die Spüllösung muss vor Verwendung eine Temperatur von 73 +/- 1 °C erreicht haben. Um den richtigen Temperaturbereich aufrechtzuerhalten, MÜSSEN vier Objektträger gleichzeitig in der erwärmten Lösung platziert werden. Wenn weniger als vier Objektträgern hybridisiert wurden, müssen Mikroskop-Objektträger mit Raumtemperatur verwendet werden, um die Anzahl auf vier Objektträger zu erhöhen. Wenn mehr als vier Objektträger hybridisiert wurden, müssen sie in mehreren Chargen gespült werden. Die Temperatur der Spüllösung muss vor dem Spülen jeder Charge wieder 73+/-1 °C erreichen. Die Deckgläser mehrerer Objektträger nicht entfernen, bevor Sie Objektträger im Wasserbad platzieren. Die Zeitmessung der Inkubation starten, wenn der letzte Objektträger in das Wasserbad gegeben wurde.

 

Denaturierungslösung (70 ml) 

49 ml Formamid, 7 ml 20x SSC (pH 5,3) und 14 ml gereinigtes H2O in einen Coplin-Färbebehälter aus Glas geben und gründlich mischen. Den pH-Wert bei Raumtemperatur mit einem pH-Messgerät messen, um zu überprüfen, dass er zwischen 7,0 und 8.0 liegt. Jede Charge der Denaturierungslösung sieben Tage lang verwenden und dann entsorgen. Zwischen den Einsätzen bei 4 °C lagern.

 

Ethanol-Spüllösungen 

Für Endkonzentrationen von 70 %, 85 % und 100 %. v/v-Verdünnungen von 100 % Ethanol mit H2O vorbereiten. Die Lösung bis zu sieben Tage lang verwenden und dann entsorgen. Wenn Lösung verdampft oder verdünnt wird, mit frischer Lösung auffüllen. Zwischen den Einsätzen bei Raumtemperatur lagern.

 
 
 
 

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