Verarbeitung von Amnionflüssigkeitsproben

  1. 2 bis 5 ml der gesamten Amnionflüssigkeitsprobe (AF-Probe) bei 1000 U/min 5 Minuten zentrifugieren. Die Probe darf nicht blutig oder bräunlich erscheinen. 
  2. Das Pellet in 2 bis 5 ml 1x Trypsin/EDTA (0,05 % Trypsin, 0,53 mM EDTA 4Na in Hanks-Salzlösung ohne CaCl2, MgCl2 6H2O und MgSO4 7H2O) erneut suspendieren und in einem 37 °C warmen Wasserbad mindestens 15 Minuten inkubieren.
  3. Die Suspension bei 1000 U/min 5 Minuten zentrifugieren.
  4. Das Pellet in 2 bis 5 ml 0,56 %igem KCl erneut suspendieren und in einem 37 °C warmen Wasserbad 20 Minuten inkubieren.
  5. Den Zellen/der hypotonen Lösung 0,8 bis 2 ml Fixiermittel (Methanol:Eisessig im Verhältnis 3:1) zugeben und im Vortex mischen.
  6. Die Suspension bei 1000 U/min 5 Minuten zentrifugieren und das Pellet in 1 ml frischem Fixiermittel erneut suspendieren. Die fixierten Proben bei 4 °C mindestens 30 Minuten einlagern bzw. so lange, bis das FISH-Verfahren durchgeführt wird. Für die langfristige Lagerung die fixierten Proben bei -20 °C in Fixiermittel aufbewahren.
  7. Vor dem Aufbringen der Zellen auf die Objektträger das Volumen der Zellsuspension entsprechend der Größe des Zellpellets anpassen. Bei Bedarf, insbesondere nach einer längeren Lagerung (> 1 Monat), die Pellets mit Fixiermittel spülen und erst dann die Objektträger vorbereiten.
  8. Zur Vorbereitung der Objektträger für das FISH-Verfahren die Zellsuspension direkt auf 1 oder 2 kalte Objektträger geben und dabei 2 Hybridisierungsbereiche (15 bis 25 &mgr;l Zellsuspension pro Bereich) schaffen.

 Anschließend mit dem FISH-Vorbehandlungskit fortfahren.

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